液质联用法测定饲料中5种霉菌毒素

（农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）四川省饲料工作总站，四川成都610041）

霉菌毒素是霉菌的次生代谢产物，是霉菌生长所导致的一个重要结果。部分霉菌毒素毒性强，致病能力强，危害大。长期以来人们错误地认为霉菌毒素问题多见于南方梅雨季节或夏季高温高湿时间。而最近几年的研究表明，霉菌毒素对动物的危害是全国性、全年性的，霉菌可以在不同地区、不同温度范围内繁殖产生。以霉菌毒素中最常见的黄曲霉毒素为例，黄曲霉毒素属于遗传毒性致癌物(致DNA损伤)，也是目前发现的化学致癌物中最强的物质之一。1993年，世界卫生组织和国际癌症研究所将黄曲霉毒素确定为一级人类致癌物。饲料中霉菌毒素对人体的危害由此可见，建立一种经济、快捷、准确度和灵敏度高的检测方法很有必要。与应永飞等的霉菌毒素检测方法相比,本文建立的我国有限量标准的几种霉菌毒素检测方法有以下创新点：①采用新开发的MycoSpin™400多功能柱对样品进行净化，减少了分析过程中对目标物的干扰。②同时检测5种霉菌毒素，所有我国现在饲料中有限量标准的霉菌毒素均可以同时检测。③正、负离子同时检测，节约了检测时间和成本，提高了检测效率。④采用13C内标定量，几种我国有限量标准的霉菌毒素均采用自己的同位素内标，检测结果更加科学、准确。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

液质联用仪配有电喷雾源(美国Aglient 1290/6460)；电子天平(0.01 mg，德国赛多利斯公司);涡旋振荡器（禾本森科有限公司）；电动振荡器（美国LKA-werke公司）；高速冷冻离心机（Biofug PrimoR公司）；N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；乙酸、乙酸铵（优级纯，天津科密欧化学试剂公司）；MycoSpin™400多功能净化柱(美国Romer公司)；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混标：1.0 μg/ml(美国Romer公司);呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素混标：10 μg/ml(美国Romer公司)；赭曲霉毒素A:10 μg/ml(美国Romer公司)。黄曲霉毒素B1([13C17]-aflatoxin B1)、呕吐毒素([13C15]-deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮([13C18]-zearale⁃none)、T-2毒素([13C24]-T-2 toxin)和赭曲霉毒素A([13C20]-ochratoxin A)同位素内标(美国Romer公司)。实验用水为超纯水机(美国MILLPORE公司)纯化的超纯水。

1.2 色谱和质谱条件

Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱（2.1 mm×100 mm,2.4 μm,美国赛默飞世尔科技公司）；柱温：35℃；进样体积：5 μl；流速：300 μl/min；流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；毛细管电压：正模式4 000 V，负模式3 500 V；干燥气温度：350℃;干燥气流量：13 L/min；雾化气压力40 psi；扫描方式、监测离子对(m/z)和其他参考条件参见表2。

名称呕吐毒素[13C15]-deoxynivalenol黄曲霉毒素G2黄曲霉毒素G1黄曲霉毒素B2黄曲霉毒素B1[13C17]-aflatoxin B1赭曲霉毒素A[13C20]-ochratoxin A T-2毒素[13C24]-T-2 toxin玉米赤霉烯酮[13C18]-zearalenone保留时间(min)2.11 2.11 3.88 4.13 4.36 4.59 4.59 5.58 5.58 5.98 5.98 6.36 6.36母离子(Fm)297.1（85）312.2(88)331.0(100)329.1(140)315.1(110)313.1(130)330.1(140)404.0(109)424.1(108)484.3(94)508.1(84)317.1(148)335.2(152)定量离子(CE)249.1（6）263.2(4)313.1(25)243.1(29)287.1(29)285.1(21)301.2(19)239.0(21)250.1(19)305.2(3)322.3(3)175.2(21)290.3(11)定性离子(CE)203.1（14）285.1(29)283.0(25)259.1(29)241.1(40)358.1(9)185.2(12)131.2(25)

1.3 溶液配制

准确移取适量标准溶液储备液，用10 mM乙酸铵-甲醇(8：2，V/V)稀释，配制成100、80、50、20、10和5 ng/ml混合标准工作液，置于冰箱中2~8℃保存，有效期3个月。提取液：乙腈：水(84：16,V/V)。

1.4 样品处理步骤

准确称取经粉碎过40目筛，0.45 mm孔径的饲料样品5 g试样(精确至0.001 g)于50 ml离心管中，加入25 ml提取液（84/16，乙腈/水溶液），再加入0.25 ml乙酸，涡旋均质3 min或者振荡90 min，过滤上清液，或10 000 r/min离心5 min，将1 ml过滤后的上清液和适当内标液加入MycoSpin™400净化柱中，盖紧净化柱，剧烈振荡混合1 min，掰断净化柱底端，将净化柱放入离心管中，以10 000 r/min离心3 min，蒸干500 μl上清液，用500 μl流动相定容，过0.22 μm滤膜，上LCMS/MS检测。

1.5 定性测定

进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致，允许偏差小于±2.5%，则可判断样品中存在响应的被测物。

1.6 定量测定

本方法采用内标法单离子定量测定，为减少基质的影响。黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2以[13C17]-黄曲霉毒素B1为内标；T-2毒素以[13C24]-T-2毒素为内标；赭曲霉毒素A以[13C20]-赭曲霉毒素A为内标；玉米赤霉烯酮以[13C18]-玉米赤霉烯酮为内标；呕吐毒素以[13C15]-呕吐毒素为内标。采用单点或曲线方程进行定量计算。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及它们与水的混合溶液为提取剂。本研究在此基础上，比较了70%、84%(V/V)的乙腈-水溶液的提取效率，并对提取时间、提取方式等条件进行了比较，玉米赤霉烯酮具体检测结果见表3，其他几种霉菌毒素的规律与玉米赤霉烯酮类似。根据检测结果的比较确定了最佳条件：84%乙腈-水溶液在振荡90 min或均质搅拌3 min时对各霉菌毒素的提取效果总体效果最佳。8种霉菌毒素的回收率均大于80%。

表3 玉米赤霉烯酮不同提取方式对回收率的影响(n=6)

2.2 净化条件的选择

固相萃取净化方法是复杂基质中痕量检测进行净化的常用方法。本研究对Myco Sep@226型清洗柱和MycoSpin™400多功能净化柱的净化效果进行了比较。实验表明，Myco Sep@226在净化黄曲霉毒素时具有良好的净化效果，回收率较稳定，但玉米赤霉烯酮的回收率及稳定性较差。采用MycoSpin™400多功能净化柱得到了较为满意的净化效果，结果更加稳定。具体检测结果见表4。因此，本研究选择Myco⁃Spin™400多功能净化柱作为本方法的净化柱。

表4 玉米赤霉烯酮不同净化柱对回收率的影响(n=6)(%)

2.3 色谱柱的选择

霉菌毒素结构中多含有羧基和羟基，属于中等极性化合物，易溶于乙腈和甲醇等极性溶剂，在一般的C18色谱柱上有较好的保留，本方法比较了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm×50 mm，1.7 μm、Agilent SB-C18 2.1 mm×50 mm，1.8 μm和Thermo BDS HYPERSIL C18 2.1 mm×100 mm,2.4 μm色谱柱，经使用标准工作液对各规格色谱柱进样分离得色谱质谱图。由试验结果可见，Thermo BDS HYPER⁃SIL C18 2.1×100 mm，2.4 μm色谱柱分离效果和灵敏度较好。标准液的选择离子流图见图1。

2.4 流动相的选择

图1 8种霉菌毒素标准品的特征离子质谱图（MRM）

要实现8种霉菌霉毒素基线分离，并且达到欧盟对各种黄曲霉毒素的限量要求，必须选择最为合适的流动相，实验采用了甲醇-水和乙腈-水两种常用的流动相，为增加霉菌毒素的离子化效率，在水相中加入10 mmol/l的乙酸铵，经比较大部分霉菌毒素使用甲醇的灵敏度要高于乙腈的，且分离度也比乙腈的要高。能够在最短的时间内得到很好的基线分离。最终确定用10 mM乙酸铵和甲醇做流动相。

2.5 内标添加时间的选择

根据样品的提取效率，在乙腈+水（84+16）充分提取下，提取效率均高于90%，在考虑内标成本较高，选择过柱前加内标。

2.6 方法的性能检验

不同种类霉菌毒素在MRM方式下的灵敏度除取决于毒素本身的结构原因外，主要与离子化的效率有关。将特定浓度的霉菌毒素加入到空白样品中，然后按本方法样品预处理方法进行。经进样分离检测，所得定量限均满足欧盟规定。曲线方程、检出限和定量限见表5。

表5 各种霉菌毒素的线性关系和检出限

2.7 方法的回收率及精密度

为了考察方法的准确度，我们对猪配合饲料、浓缩饲料和玉米样品进行了回收率试验，采用不同水平的添加量，每个水平平行测定6份。平均回收率在80%~100%之间，相对标准偏差小于10%，表明方法准确度、精密度良好。具体结果见表6。

表6 8种霉菌毒素平均回收率和相对标准偏差(n=6)

2.8 样品的测定

为了进一步考察本方法及仪器的准确度，我们对禽配合饲料、浓缩饲料和玉米样品进行了与免疫亲和柱方法的比较试验。对筛选出的含有霉菌毒素的样品，同时进行了本方法与免疫亲和柱方法检测，检测结果见表7。由结果可知，该方法与免疫亲和柱方法结果相对标准偏差最大为8.66%，进一步表明方法准确度良好。

3 结论

本文采用乙腈/水(84/16)混合溶剂为提取液,经MycoSpin™400净化柱净化，内标法定量，平均回收率在80%~100%之间，相对标准偏差小于10%。方法定量限（LOQ）范围在1.0~40 μg/kg之间。方法前处理简便、快速，灵敏度、准确度高。能够适用于饲料及饲料原料中5种霉菌毒素的检测。