中链脂肪酸的抗菌作用：辛酸对悉生卤虫无节幼体接种虾致病菌哈维氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用

（印度Manonmaniam Sundaranar大学海洋科学和技术中心海洋生物技术实验室,Rajakkamangalam,Kanyakumari区,泰米尔纳德邦629502）

卤虫无节幼体被广泛认为是海洋鱼类和甲壳类动物孵化场最好的天然的长期可储存的活饵料（Lavens等，1996）。这是因为卤虫属拥有一些独特的特征如体积小，容易摄食(Leger等，1986)，高营养价值(Browne等，1991)，对不同的培养环境具有高耐受力(Leger等，1987)，繁殖周期短(Reeve1963；Pwe⁃soone等，1980)等。卤虫属也被用来作为提供营养物质的带菌物质(Watanabae等，1983)，抗菌剂(Dixon等，1995)，疫苗(Campbell等，1993)和所有上述提到的产品都可能是通过提高原微生物菌群的特性而起到对宿主机体正效应作用。卤虫属也是一个被用来研究对虾、龙虾和其他甲壳虫类疾病很好的生物体模型(Overton等，1981；Verschuere等，1999，2000a)。最近在丰年虾卤虫上研究显示，在一个悉生测试系统的仪器中研究食物成分在攻毒或不攻毒情况下对丰年虾卤虫存活和生长的影响(Marques等2004、2005)。最近，建立一个限菌系统，使幼虫在无菌条件下孵化、生长，为已知的细菌与宿主-微生物相互作用的研究提供便利，尤其是卤虫幼体(Marques等，2006)。

游离脂肪酸对病原微生物（包括包膜病毒、衣原体和细菌）具有抑制作用(Kabara等，1972；Kabara，1978；Isaacs等，1995；Petschow等，1996；Bergsson等，1998，1999)。关于脂肪酸的抗菌性能，大多数研究都集中在中链和长链脂肪酸。虽然短链和中链脂肪酸的抗菌机制不完全明白，但是它们能够发挥抑菌和杀菌性能取决于生物体的生理状况和外部环境的物理化学特性(Ricke，2003)。在未解离的形式，短链和中链脂肪酸能通过细菌细胞膜和游离于碱性细胞质，从而增加了细胞内的质子浓度(Cherrington等，1991；Sun等，1998)。结果表明，细胞必须消耗能量使细胞质pH值维持在合适的水平。能量不能被用作其他代谢过程，从而抑制了细胞的生长。基于以上因素，本研究评估了中链脂肪酸辛酸对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌在体外的抗菌作用和辛酸在丰年虾攻毒这两种菌时的保护作用。

1 材料和方法

体外攻毒试验参照Defoirdt等(2005)方法，100尾卤虫无节幼体(龄II)在孵化后被转入到4个无菌离心管中，每个离心管中随机分配25尾，并含有过滤和灭菌海水及10 mM的辛酸。正对照组不含辛酸。试验介质的pH值调整到7.0。卤虫幼体饲喂蒸压悬浮的嗜水气单胞菌（LVS3）,细胞密度大约为每日107CFU/ml。饲喂前，菌株在过滤的海水中的海洋琼脂培养液中过夜，蒸压后加入到卤虫幼体培养基中。然后，离心管被分别接种105CFU/ml的哈维氏弧菌和副溶血性弧菌。离心管在28℃旋转器中离心孵育。测定60 h内卤虫幼体的死亡率。每6 h测定一次每个处理的存活百分数。为了上述目的，在饲养和添加细菌前通过用肉眼记录卤虫幼体的数量，这都是在未打开并暴露在白炽灯下和维持悉生环境的透明的离心管中进行的。卤虫无节幼体的累计死亡率指数(CMI)通过每次间隔记录的死亡数的总和来计算(Immanuel等2001,2004,2007)，公式：

CMI=Dx1+Dx2+Dx3…Dxn。

D是x1，x2，x3…xn每次的死亡个数。

2 结果

2.1 第一个试验：测定不同浓度的辛酸(1、10和100 mM)对病原菌哈维氏弧菌和副溶血性弧菌生长的影响(图1)

图1 不同浓度辛酸和不同时间间隔对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌生长的影响

对照组，病原体的生长直到试验结束。在高浓度辛酸组(100 mM)，两种菌在5 h内被完全抑制。但当辛酸1 mM和10 mM浓度时，病原菌的生长没有被完全抑制。

2.2 第二个试验：pH值不同时辛酸对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌生长的影响

测定pH值为5、6、7辛酸浓度为10 mM时对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌的抑制作用（图2）。与pH值6、7（43%~46%）时相比，pH值为5（65%~80%）时辛酸对抑制两种菌生长的作用最强。

图210 mM辛酸在不同pH值条件下和不同时间间隔对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌生长的影响

2.3 第三个实验：体外攻毒实验

给卤虫无节幼体接种哈维氏弧菌和副溶血性弧菌，在攻毒试验期间从接种病毒开始到第6 h时死亡（表1）。在6 h期间，正对照组(无辛酸组)在攻毒哈维氏弧菌和副溶血性弧菌后其死亡率分别为23.3%和21.65%。同时，试验组即添加辛酸组死亡率分别为20%和16.65%。以此同时，负对照组(无病原菌和辛酸)无死亡率。

表1 添加10 mM辛酸pH值为7的培养基中攻毒哈维氏弧菌和副溶血性弧菌的卤虫无节幼体的累积死亡百分数

卤虫无节幼体在分别攻毒两种菌时的死亡率百分数随着攻毒时间的延长呈线性增加。60 h内，正对照组攻毒两种菌后死亡率为100%。但是在添加10 mM辛酸的试验组，攻毒哈维氏弧菌和副溶血性弧菌的卤虫无节幼体的死亡率分别为79%和76%。同时，负对照组的死亡率只有17%。统计分析表明，在试验期（60 h）各组间的累积死亡率差异显著（P<0.05）。

2.4 CMI和降低的死亡率

攻毒哈维氏弧菌的正对照组的卤虫无节幼体的累计死亡率指数(CMI)为24 692.76，加10 mM辛酸后死亡率降低到16.3%，负对照为84.55%(表2)。

表2 不同处理组的CMI和降低死亡率的百分数

同样，攻毒副溶血性弧菌的正对照组的卤虫无节幼体的累计死亡率指数(CMI)为23 599.20，加10 mM辛酸后死亡率降低到20.61%，负对照为83.84%。通过t检验统计分析各组间的CMI呈显著性差异(P<0.05)。

3 讨论

脂肪酸已被开发作为几个世纪的抗菌剂(Sun等，2002；Hogan等，1987；Wang等，1992；Petschow等，1996)。本试验，我们研究不同浓度的辛酸(1、10和100 mM)对哈维氏弧菌和副溶血性弧菌在pH值为6时的抗菌效果。在100 mM浓度、5 h时100%完全抑制病菌的生长。但是当辛酸浓度为1 mM和10 mM时的抑菌效果所需时间延长。与本研究报道一致的是Defoirdt等(2006)报道不同浓度的短链脂肪酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸(1、10和100 mM)在pH值为6时对坎氏弧菌的生长抑制的影响。进一步研究表明，当辛酸浓度为100 mM时，所有的短链脂肪酸都显示出对坎氏弧菌生长100%抑制，然而在其他两个浓度时无效果。根据上述调查结果，Wolin(1969)报道，在pH值为6、10 mM的短链挥发性脂肪酸部分抑制大肠杆菌的生长。相似地，Van Immerseel等(2003)也报道，在同样的pH值条件下，辛酸为100 mM时短链脂肪酸完全抑制肠炎沙门氏菌。

此研究还揭示辛酸对虾病原菌生长抑制活性的pH值依赖性。在最低pH值为5时，生长抑制最高，然而在高pH值(6和7)时生长抑制相对较低(42%~46%)。Defoirdt等(2006)报道，短链脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)对坎氏弧菌的生长抑制作用也具有pH值依赖性。他们指出pH值为5时，生长被完全抑制，然而在pH值为6时，生长抑制被推迟，在pH值为7时无抑制效果。本研究结果与Wolin(1969)，Mc Han等(1993)和Van Immerseel等(2003)研究在不同pH值条件下短链脂肪酸对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌生长抑制效果的结果存在相关性。生长抑制效果依赖pH值的原因实际上是因为在低pH值时，占主导地位的未解离的脂肪酸能通过细胞膜(Sun等，1998)。

本研究中，体外攻毒试验结果表明，卤虫无节幼体在分别攻毒副溶血性弧菌和哈维氏弧菌后的试验组的死亡率是非常低的(分别是20.61%和16.30%)。Defoirdt等(2006)也报道在攻毒坎氏弧菌后，卤虫幼体最好存活率组是添加了20 mM的短链脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)组。他们的研究表明，在pH值7时攻毒坎氏弧菌情况，分别添加了20 mM的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸组的卤虫幼体的存活率分别为45%、48%、48%、42%和47%。此前，无论是体外和体内研究都报道辛酸对各种鱼类寄生虫具有显著的抗寄生虫作用。并且据观察辛酸对鱼类健康无任何有害作用(Hirazawa等，2001a，b，c)。Wang等（1992）报道，脂肪酸的抗菌作用随着链长度的增加而降低，中链脂肪酸的抗菌作用比长链脂肪酸更强。相似地报道，Isaacs等（1995）指出，含有8~12个碳的脂肪酸比长链脂肪酸的抗病毒和抗菌效果更好。辛酸含8个碳，中链脂肪酸与长链脂肪酸相比，疏水性较低且更易溶，其杀菌效果更好。

虽然辛酸对细菌的确切抑菌机制还不清楚，但众多的假设已经提出来解释游离脂肪酸的一般抗菌活性模式。一种假设是短链和中链脂肪酸以它们未解离的形式扩散到细菌细胞原生质内，然后解离，从而导致细胞内酸化(Sun等，1998)。较低的细胞内pH值可导致细胞内的酶失活(Viegas等，1991)和氨基酸转运抑制(Freese等，1973)。因为脂肪酸被认为是通过多种机制来杀死细菌的，这些分子引起潜在的细菌耐药性可以忽略不计。Beegsson等(1999)研究表明，游离脂肪酸发挥它们对细菌生物膜的抗菌效应，因此细菌耐药性出现的几率是不太可能的。Kabara(1978)和Monk等(1996)也报道与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌对脂肪酸的抗菌作用不太敏感。总之，辛酸对在限菌卤虫无节幼体培养基中攻毒的哈维氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用归功于它是中链长度。更进一步的是，本研究结果为辛酸可以作为一种抗生素替代品替代或者辅助抗生素治疗水产养殖中发生的发光弧菌病提供判断依据。