土槿乙酸B体外抗真菌活性及对白色念珠菌麦角甾醇生物合成的影响

刘丽英，陈 虹，高默杰（.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院检验科，天津 3006；.中国人民武装警察部队后勤学院生药学教研室，天津 3006）

土槿乙酸B体外抗真菌活性及对白色念珠菌麦角甾醇生物合成的影响

刘丽英1，陈 虹2，高默杰1（1.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院检验科，天津 300162；2.中国人民武装警察部队后勤学院生药学教研室，天津 300162）

目的：研究土槿乙酸B（PLAB）的体外抗真菌活性和对白色念珠菌细胞膜中麦角甾醇生物合成的影响。方法：采用微量液体稀释法研究PLAB的体外抗白色念珠菌、新生隐球菌、絮状表皮癣菌的活性。将白色念珠菌经不同浓度PLAB及氟康唑作用28 h后，经过皂化、提取未皂化脂，采用高效液相色谱法测定其麦角甾醇的含量变化。结果：PLAB对白色念珠菌、新生隐球菌、絮状表皮癣菌这三株菌株的MIC50分别为16、32、16 μg·mL-1。PLAB能使白色念珠菌中的麦角甾醇含量下降（P ＜0.05），且含量变化呈明显的剂量依赖性。结论：PLAB具有较强的抗真菌作用，通过抑制真菌的麦角甾醇生物合成而发挥高效抗真菌活性。

土槿乙酸B（PLAB）；高效液相色谱法；白色念珠菌；麦角甾醇

伴随癌症、HIV和器官移植患者人数的增加，免疫抑制剂和广谱抗生素在临床的大量使用，使得深部真菌感染率已由20世纪50年代的0.3%上升到11.3%，上升了40倍[1]。80%以上AIDS患者受到真菌，尤其是白色念珠菌感染，深部真菌感染已成为许多疾病的主要死亡原因之一。真菌病症顽固且反复，用药周期较长，现有的很多药物因毒副作用较强而使患者用药依从性差。

土槿乙酸B（pseudolaric acid B，PLAB）是我国松科植物金钱松（pseudolarix raempferi gordon）的根皮及近根皮（土槿皮）中的主要成分之一，为二萜类化合物，天然产物中许多具有此类结构的化合物具有显著的抗肿瘤作用[2-3]，PLAB还具有显著的抗真菌活性[4]，目前，对于其抗真菌作用机制的研究较少。本文采用HPLC法测定经PLAB作用前后白色念珠菌细胞膜中麦角甾醇的含量变化，以揭示其对麦角甾醇生物合成的影响，为研究PLAB抗真菌作用的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Millipore纯水仪（Millipore公司）；HZQ-X100A型恒温振荡培养箱、PH 240型培养箱/干燥箱、SN-CS-2D单人净化工作台（上海一恒科学仪器有限公司）；5000 μL、1000 μL加样枪（法国Gilson公司）；Mettler AE260（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；P1000高效液相色谱仪（美国热电公司）；N2000色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；CSF-1A超声发生器（上海超声波仪器厂）；Phenomenex 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex公司）；卧式矩形压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）。

甲醇（天津市康科德科技有限公司）；石油醚（天津市科锐思精细化工有限公司）；二甲基亚枫（DMSO，天津市百世化工有限公司）；麦角甾醇标准品（美国Sigma公司）；沙保琼脂培养基、沙保液体培养基（北京奥博星生物技术责任有限公司）；氟康唑注射液（上海信谊药厂有限公司）。

PLAB，分子量432，乳白色粉末，难溶于水，纯度 ＞ 95%，由武警后勤学院生药学教研室提供，DMSO配制，高压灭菌备用。

1.2 菌种

白色念珠菌C1a、新生隐球菌、絮状表皮癣菌购自中国医学真菌保藏中心。

1.3 溶液及培养基配制

皂化剂（新鲜配制的含15% NaOH的95%乙醇溶液）；麦角甾醇标准品（0.051 2 g麦角甾醇标准品溶于100 mL甲醇中，超声波溶解，即为0.512 mg·mL-1麦角甾醇标准品溶液）；YEPD培养基（10%酵母浸粉、20%胰蛋白胨、20%葡萄糖，溶于三蒸水中，高压灭菌）。

1.4 药物敏感性实验

根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的M27A方案，体外测定土槿乙酸对白色念珠菌C1a、新生隐球菌、絮状表皮癣菌的MIC。

96孔细胞培养板，第1孔加入200 μL RPMI 1640培养液作为空白对照。2 ～ 11孔按药物浓度递减的顺序加入PLAB溶液100 μL及浓度为5×104cfu·mL-1的菌液100 μL，使PLAB的终浓度分别为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg·mL-1。第12孔加入100 μL RPMI 1640培养液和100 μL菌液作为生长对照。28 ℃培养24 h（絮状表皮癣菌培养1周）。

1.5 色谱条件

Phenomenex色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:100%甲醇；流速:1.0 mL·min-1；检测波长: 210 nm；柱温:室温。麦角甾醇在此条件下的保留时间为11.698 min，柱效和峰形良好。

1.6 样品的制备

取沙氏斜面上活化2 d的白色念珠菌C1a接种于YEPD液体培养基中，30 ℃，150 r·min-1振荡培养28 h，活化2次，使其处于指数生长期后期[5]。用改良沙堡氏液体培养基调整真菌密度至5×108cfu·mL-1。取此浓度菌液2 mL于250 mL锥形瓶，加YEPD液体培养基98 mL，不同浓度PLAB 100 μL（终浓度分别为0、0.064、0.128、0.256 μg·mL-1），同时以终浓度为0.25 μg·mL-1的氟康唑作为阳性对照组，30 ℃、150 r·min-1振荡培养28 h。2000 r·min-1离心10 min，PBS洗涤2次至上清液无色，去上清液，称各湿菌质量。精密称取湿菌0.5 g，加PBS 2.5 mL和皂化剂6 mL，混匀，80 ℃水浴皂化60 min。加石油醚（沸程30 ～ 60 ℃）6 mL提取3次，合并提取液，加水6 mL洗涤，醚层于60 ℃水浴挥干，得未皂化脂（nonsaponifiable lipids，NSLs），加甲醇使溶液体积为0.5 mL·g-1湿菌，– 20 ℃保存行HPLC测定。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，比较生长对照组和不同浓度PLAB作用后各试验组白色念珠菌麦角甾醇含量的差异，评价PLAB对白色念珠菌麦角甾醇生物合成影响的程度，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物敏感性实验

PLAB对白色念珠菌C1a、新生隐球菌、絮状表皮癣菌的MIC50分别为16、32、16 μg·mL-1。

2.2 白色念珠菌样品中麦角甾醇含量

通过标准品确定了麦角甾醇的峰位（图1），以标准品峰面积均值为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制出标准曲线[6]。然后对样品进行HPLC分析（图2），通过将所得峰面积与标准曲线比较，可以计算出样品中麦角甾醇的浓度，从而计算出每克湿菌中含有的麦角甾醇微克数。本研究测定了经不同浓度的PLAB及氟康唑作用28 h后每克样品中的麦角甾醇含量（结果见表1），发现麦角甾醇含量的降低与PLAB浓度呈剂量依赖性关系，各剂量组与对照组及各剂量组之间相比均有明显的统计学意义（P ＜ 0.05），与阳性对照氟康唑相比也具有很好的相关性，说明PLAB抑制了白色念珠菌麦角甾醇的生物合成。

3 讨论

图1 麦角甾醇标准品的HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of standard ergosterol

图2 PLAB作用28 h后白色念珠菌麦角甾醇含量的HPLC色谱图A – 0 μg·mL-1PLAB, B – 0.064 μg·mL-1PLAB, C – 0.128 μg·mL-1PLAB, D – 0.256 μg·mL-1PLAB, E – 0.25 μg·mL-1氟康唑Fig 2 HPLC chromatograms of ergosterol in Candida albicans treated with PLAB and fl uconazole for 28 hA – 0 μg·mL-1PLAB, B – 0.064 μg·mL-1PLAB, C – 0.128 μg·mL-1PLAB, D – 0.256 μg·mL-1PLAB, E – 0.25 μg·mL-1fl uconazole

表1 不同浓度PLAB及氟康唑处理后白色念珠菌麦角甾醇的含量. n = 3Tab 1 Ergosterol content in Candida albicans treated with different concentrations of PLAB and fl uconazole. n = 3

真菌细胞膜为液态镶嵌模型，在排列成双层结构的磷脂中夹杂有大量的麦角甾醇类化合物，含有较高含量的糖，一些合成甘露聚糖、β-葡聚糖、几丁质等细胞壁组分所必须的酶也位于细胞膜上。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要成分，通过与磷脂结合稳定磷脂相来增加膜的稳定性。麦角甾醇缺乏以及非平面甾醇前体累积均会导致真菌膜的破裂，麦角甾醇在确保细胞膜结构的完整性、流动性、结合酶的活性、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用。因此，抑制麦角甾醇的生物合成必将破坏真菌的细胞膜结构，从而起到抗真菌作用。麦角甾醇的生物代谢途径已成为研究新型抗真菌药物的重要靶位，临床上已发现了很多通过抑制麦角甾醇的生物合成来达到抑菌效果的抗真菌药物[7]，如氟康唑通过抑制P450酶，抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成；以两性霉素B为代表的多烯大环内酯类抗真菌药物可直接和细胞膜上的麦角甾醇结合，形成抗生素-甾醇复合物，破坏细胞膜的渗透性；以特比萘芬为代表的烯丙胺类抗生素能抑制角鲨烯环氧化酶，引起角鲨烯在质膜上累积，造成膜的损坏。有学者采用HPLC法来测定土壤、植物和药品等中的麦角甾醇的含量[8]。

本文通过HPLC法测定发现经PLAB作用后白色念珠菌细胞膜中麦角甾醇含量随着PLAB浓度的增高而呈下降趋势，且呈一定的剂量依赖性(P ＜ 0.05)，而与阳性对照药物氟康唑比较的结果也进一步证明PLAB显著抑制了白色念珠菌中麦角甾醇的生物合成。由于HPLC测定时需要标准品，而羊毛甾醇等其他的中间产物没有进行测定，且麦角甾醇合成的上游成分角鲨烯应用此法也未能检测到足以测量的峰位。因此，PLAB到底是作用于麦角甾醇生物合成的哪一个环节，是如何发挥作用，还有待我们进一步研究。

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[2]王丹，辛彦，肖玉平.土槿乙酸抗肿瘤作用研究进展[J].肿瘤防治研究，2013，40（3）:293-296.

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Antifungal activity of pseudolaric acid B in vitro and its effect on ergosterol biosynthesis in Candida albicans

LIU Li-ying1, CHEN Hong2, GAO Mo-jie1(1. Department of Laboratory Medicine, the Af fi liated Hospital of Medical College of Chinese People′s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; 2. Department of Pharmacy, Logistics University of Chinese People′s Armed Police Force, Tianjin 300162, China)

Objective:To study antifungal activity in vitro and the effect of pseudolaric acid B (PLAB) on ergosterol biosynthesis in the cell membranes of Candida albicans.Methods:Microdilution method was used to determine the susceptibility of fungus (Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Epidermophyton floccosum) to PLAB. The Candida albicans were incubated for 28 h with different concentrations of PLAB and fl uconazole, and the content of ergosterol was detected by HPLC after saponi fi cation and extraction.Results:The MIC50(minimum inhibition concentrations) of PLAB to Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Epidermophyton fl occosum was 16, 32, 16 µg·mL-1respectively. PLAB could decrease the content of ergosterol (P ＜0.05) in Candida albicans with a dose-dependent manner.Conclusion:PLAB had remarkable antifungal activity by inhibiting the ergosterol biosynthesis in fungi.

Pseudolaric acid B (PLAB); HPLC; Candida albicans; Ergosterol

R96

A

1672 – 8157(2014)02 – 0085 – 04

2013-12-04

2014-01-14）

国家自然科学基金资助项目（30171108）

陈虹，女，博士生导师，教授，研究方向:天然产物的活性成分研究。E-mail:chenhongtian@yahoo.com.cn

刘丽英，女，主管技师，讲师，研究方向:药物对真菌的影响。E-mail:lly0981556@126.com