三七总皂苷中代表性皂苷含量测定方法学的建立及稳定性研究

陆 燕，潘 旭（北京积水潭医院中药房，北京 100035）

三七总皂苷中代表性皂苷含量测定方法学的建立及稳定性研究

陆 燕，潘 旭（北京积水潭医院中药房，北京 100035）

目的：建立同时测定三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三种成分的含量测定方法，并对其各种状态下的稳定性进行研究。方法：以乙腈-水系统作为流动相，采用高效液相-梯度洗脱法，同时测定三七总皂苷中三种成分的含量，并考察方法的专属性、线性、精密度和回收率；测定四种pH值溶液中三种皂苷成分的稳定性以及在高温、高湿和强光照射条件下，三七总皂苷粉末中三种皂苷成分的稳定性。结果：方法学验证结果显示，在选定的梯度洗脱条件下，方法专属性良好，三种皂苷可有效分离和定量；在各自的线性范围内线性良好；精密度RSD值均小于2%；三种皂苷的平均回收率分别为（98.98 ± 0.60）%、（98.86 ± 0.34）%和（100.19 ± 0.64）%，方法准确性良好。稳定性研究结果显示，在溶液状态下，三种皂苷的稳定性趋势基本一致，稳定性与pH值密切相关，在pH 1.2溶液中药物迅速降解，24 h含量即降低了约80%；而在pH 4.5溶液、pH 6.8溶液以及水中，三种成分的稳定性均良好，24 h内含量未发生明显变化；而在三七总皂苷粉末中，三种代表性皂苷对湿、热和光照均不敏感，10 d内含量基本保持稳定；但是在高湿条件下，粉末有一定的吸湿性。结论：所建立的液相方法准确、可靠，溶液状态下三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的稳定性与pH密切相关，随pH的降低稳定性变差，而在固体状态下则稳定性良好。

三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；稳定性；梯度洗脱

三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是中药三七的主要有效成分，在心血管系统、神经系统及免疫系统等多方面具有良好的药理作用，临床应用广泛，具有良好的新药开发价值[1-4]。其中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1是公认的代表性成分，有文献[5-7]报道其单用或合用具有较好的抗老年痴呆作用。结合该病症的用药特点，我们拟将之作为组方的主要成分，尝试开发缓释微丸，以期减少给药次数，提高用药顺应性。本文将以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1作为代表性成分，对三七总皂苷在各种条件下的稳定性情况进行全面的研究，以便于对进一步的制剂开发和制剂工艺的选择提供参考。关于三七总皂苷的含量测定，目前有多种条件，主流方法均为液相色谱法，但由于流动相组成和梯度的不同，出峰时间上存在较大的差异。我们在《中国药典》方法的基础上，调整了流动相梯度，在保证良好分离的前提下，使各皂苷出峰时间明显提前，提高了工作效率，在本研究中也对该方法进行了方法学验证。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（包括四元泵、VWD检测器，美国Agilent公司）；BP125D电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（北京陆希科技有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）。

三七皂苷R1（中国药品生物制品检定所，纯度95.9%，批号110745-200617)；人参皂苷Rg1（中国药品生物制品检定所，纯度96.3%，批号110703-201027）；人参皂苷Rb1对照品（中国药品生物制品检定所，纯度92.6%，批号110704-200921）；三七总皂苷（云南金泰得三七产业股份有限公司，批号20080402）；乙腈为色谱纯（Fisher公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；浓盐酸、浓硫酸、无水乙酸钠、氢氧化钠（北京化学试剂有限公司）；冰醋酸、磷酸二氢钾（天津市光复科技发展有限公司）；甲醇等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，0 ～ 6 min A相比例为20%，25 min时A相比例变为40%，而30 min时则回到20%，并保持此比例5 min；流速:1.0 mL·min-1；检测波长:203 nm；进样量: 20 μL；柱温:30 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品各约10 mg，分别置3个10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液，冷藏保存。精密量取各储备液1 mL，分别至10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度均约为100 µg·mL-1的对照品溶液。

分别取上述3种储备液一定体积，至同一容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液取一定量三七总皂苷样品，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇，超声处理使溶解，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性实验主要目的是考察在选定的液相条件下，各种对照品、溶媒等的出峰是否存在相互干扰。取混合标准品溶液以及溶媒（甲醇）依次进样测定，记录色谱图，见图1所示。

图1 三七总皂苷典型色谱图A – 混合标准品溶液，B – 溶剂（甲醇）；1 – 三七皂苷R1，2 – 人参皂苷Rg1，3 – 人参皂苷Rb1Fig 1 Typical chromatograms of Panax notoginseng saponins (PNS)A – mixed standard solution, B – solvent (methanol); 1 –notoginsenoside R1, 2 – ginsenoside Rg1, 3 – ginsenoside Rb1

由图1可知，由于所选波长为未端吸收，甲醇中存在一定的杂质峰，但是在选定的液相条件下，三种皂苷的出峰时间分别约为16、17、25 min，可以有效检出和分离，没有相互干扰，表明方法专属性良好。

2.3.2 标准曲线及线性范围分别取配制好的对照品储备液适量，甲醇稀释制成浓度分别约为1、2、5、10、20、50、100、200、400 μg·mL-1的一系列混合标准品溶液，依次进样测定，记录峰面积，以峰面积（A）对浓度（C）作图，进行线性回归，考察方法的线性。结果如下:三七皂苷R1标准曲线线性方程为:A = 6.05 C + 38.21，r = 0.999 8，线性范围为1.014 ～ 101.400 μg·mL-1。人参皂苷Rg1标准曲线线性方程为:A = 6.01 C + 21.29，r = 0.999 8，线性范围为1.001 ～ 400.223 µg·mL-1。人参皂苷Rb1标准曲线线性方程为:A = 4.68 C + 15.80，r = 0.999 8，线性范围为0.962 ～ 384.875 µg·mL-1。

2.3.3 精密度实验取“2.3.2”中浓度约为20 μg·mL-1的混合标准品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，考察方法的精密度。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的RSD值分别为0.50%、0.77%、0.49%，均小于2%，方法精密度良好，详见表1。

表1 精密度实验结果. n = 6Tab 1 Results of the precision test. n = 6

2.3.4 加样回收率精密量取已知浓度的混合标准品溶液0.4、0.5、0.6 mL，分别置EP管中，氮气吹干溶剂，每浓度下平行操作3份。精密量取三七总皂苷供试品溶液1 mL，分别加入上述9个EP管中，涡旋、超声使完全溶解后，进样测定，方法回收率良好，详见表2。

表2 加样回收率实验结果. n = 3Tab 2 Results of the recovery test. n = 3

2.3.5 稳定性实验取“2.3.2”中浓度约为20 μg·mL-1的混合标准品溶液，置液相色谱进样器中，于室温下放置，分别于第0、2、4、6 h进样测定。记录各皂苷峰面积，并计算RSD值，考察在室温进样的条件下工作液的稳定性。结果显示，样品溶液室温放置8 h内，各皂苷含量基本保持稳定，可以满足自动进样器的要求，详见表3。

表3 工作液稳定性实验结果Tab 3 Results of the stability of working solutions

2.4 三七总皂苷稳定性研究

2.4.1 不同pH值溶液中各皂苷稳定性研究精密称取三七总皂苷约20 mg，置于25 mL容量瓶中，加入盐酸溶液（pH = 1.2）使溶解，并定容至刻度，于室温下放置，分别于第0、2、4、8、12、24 h取样测定，记录各主峰的峰面积，考察在此溶液中各皂苷的稳定性。其他三种介质醋酸盐缓冲液（pH = 4.5）、磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）和水同上操作。

结果显示，溶液状态下，皂苷的稳定性与pH值密切相关。在pH 1.2溶液中药物迅速降解，非常不稳定；而在实验的其他几种介质中，三种皂苷稳定性良好，提示在三七总皂苷制剂研究过程中应注意避免低pH值溶媒。详见表4。

2.4.2 固体状态下药物稳定性研究通过影响因素实验，考察固体粉末状态下三七总皂苷的稳定性。分别设置高温（60 ℃）、高湿[25 ℃，相对湿度（90 ± 5）%]和强光照射（4500 ± 500）Lx组，于第0、5、10天取样测定，以吸湿增重以及总皂苷含量（三种代表性皂苷含量之和）作为指标。结果显示，在高湿条件下，三七总皂苷粉末略有吸湿，但3种条件下总皂苷的含量均基本保持不变，稳定性良好。提示本品在固体粉末状态下比较稳定，在制剂过程中无需特殊的实验条件。详见表5。

表4 不同pH值溶液中三七总皂苷各成分稳定性实验结果Tab 4 Results of the stability about PNS in different pH solutions

表5 三七总皂苷影响因素实验结果Tab 5 Results of the stability about PNS in stress factors test

3 讨论

3.1 三七总皂苷指标性成分

PNS是中药三七的活性部位，据报道其中含有的各种皂苷类成分超过11种，但其中药理活性的研究多集中于含量较高的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三种成分。所以在本研究中，着重以这三种成分的稳定性作为PNS稳定性的指标，作为制剂研究的参考。在将来的体内研究中，将考虑采用LC-MS/ MS对多种皂苷成分进行测定研究，以利于更为全面地反映制剂质量和体内过程。

3.2 稳定性研究

在化药制剂研究中，稳定性研究作为制剂处方前研究的一个重要内容，近年来越来越受到人们的重视。但在传统中药制剂的研究中，对于整个制剂流程中某成分的含量变化或稳定性并没有进行特别的关注。从提取浓缩到分离纯化，从提取物粉碎到制剂成型，有很多环节涉及到热、湿或光照等因素，甚至是不同的酸碱性环境等，提取物中某些关键成分在此过程中可能会被破坏、降解，影响产品的质量。在PNS的制剂研究中，我们首先进行了不同条件下三种皂苷成分的稳定性研究，以期了解其稳定性情况，为制剂工艺的选择提供参考。结果显示，在酸性介质中，三种皂苷稳定性差，降解迅速，所以在制剂过程中应避免采用酸性辅料和酸性溶媒。

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Study on the methodology establishment of content determination and stability of representative saponins in Panax notoginseng saponins

LU Yan, PAN Xu(Dispensary of Traditional Chinese Medicine, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China)

Objective:The HPLC method for simultaneous determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Panax notoginseng saponins (PNS) was established to study the stability of the saponins under different states.Methods:Acetonitrile-water system was used as the mobile phase, and the method speci fi city, linearity, precision, recovery were studied. The stability of the three saponins in different pH solutions and solid state was evaluated.Results:The results of method validation showed good speci fi city, effective separation and quanti fi cation, as well as good linearity of the three saponins in their linear range. The precision RSD values were less than 2%, average recovery rates were (98.98 ± 0.60)%, (98.86 ± 0.34)% and (100.19 ± 0.64)% for the three saponins respectively. The stability results showed that the stability of the three saponins was closely related to the pH value under the solution state, with rapid degradation about 80% in 24 h in pH 1.2 solutions and little degradation in the other test medium. In the solid powder state, the stability of saponins was good under the experimental high temperature, high humidity and highlight conditions, while a little moisture absorption was found in the high humidity conditions.Conclusion:The HPLC method was reliable. Stability of three saponins was closely related to the pH value of solution, while they were stable under solid state.

Notoginsenoside R1; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rb1; Stability; Gradient elution

R917

A

1672 – 8157(2014)02 – 0088 – 04

2013-09-10

2013-11-07）

陆燕，女，主管药师，主要从事临床药学工作。E-mail:caojie2002@163.com