HPLC法测定人血清中万古霉素及去甲万古霉素浓度及临床应用

黄晓会，刘　艳，张　健（上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092）

HPLC法测定人血清中万古霉素及去甲万古霉素浓度及临床应用

黄晓会，刘艳，张健（上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092）

目的：建立同时测定血清中万古霉素及去甲万古霉素浓度的高效液相色谱法。方法：采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-磷酸二氢钾缓冲液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速：1 mL·min-1；检测波长：236 nm；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；二极管阵列检测。内标法定量，万古霉素与去甲万古霉素互为内标。结果：去甲万古霉素低、中、高3个浓度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分别为98.5%、102.2%、103.1%，万古霉素低、中、高3个浓度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分别为96.2%、100.8%、103.5%，日内精密度RSD小于3.24%，日间精密度RSD小于6.12%。结论：本方法准确度高，灵敏度好，操作简便，符合万古霉素及去甲万古霉素血药浓度监测和药代动力学研究的要求。

万古霉素；去甲万古霉素；高效液相色谱法

万古霉素（vancomycin）属于三环糖肽类抗菌药物，临床上主要用于敏感革兰阳性菌，特别是严重耐药的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致心内膜炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病，全球仅9株金黄色葡萄球菌耐药，被誉为抗生素最后一道防线。其具有一定的抗生素后效应，为时间依赖性抗菌药物，并且具有耳、肾毒性和血栓性静脉炎等严重不良反应，临床应用时常需进行血药浓度监测，并及时调整给药方案。本实验参考现有文献[1-9]报道的9种HPLC法测定血清中万古霉素与去甲万古霉素的方法，对比其前处理方法与色谱条件，对沉淀蛋白剂进行优化分析、验证，最终建立了一种较为精确、快速、实用的万古霉素及去甲万古霉素的测定方法，并应用于本院血药浓度监测。

1　材料与方法

1.1仪器与试药

1260高效液相色谱仪（包括G1367E自动进样器、G1311B四元泵、G4212B二极管阵列检测器，美国Agilent公司）；Milli-Q纯水器（Millipore公司）；Vortex KB3型旋涡混悬器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；5424R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。万古霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130329-200501）；去甲万古霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130359-200503）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；磷酸、磷酸二氢钾、三氯醋酸、硫酸锌均为分析纯。

1.2溶液的配制

1）标准储备液:精密称取万古霉素对照品和去甲万古霉素对照品各20 mg，用水定容至5 mL的容量瓶中，配成质量浓度为4000 μg·mL-1的对照品工作液。2）磷酸二氢钾缓冲液:精密称取磷酸二氢钾6.805 g，用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸调节pH值至3.2，配制成0.05 mol·L-1的磷酸二氢钾缓冲液。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件色谱柱:Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-磷酸二氢钾缓冲液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速:1 mL·min-1；检测波长:236 nm；进样量:25 μL；柱温:30 ℃。

1.3.2样品预处理精密取待测人血清样品200 μL于1.5 mL Eppendorf管中，加入内标（万古霉素或去甲万古霉素）溶液200 μL（12.5 mg·mL-1），加入4%的硫酸锌溶液100 μL，涡旋振荡1 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

1.3.3标准曲线的制备精密量取血清900 μL，加入4000 μg·mL-1的万古霉素/去甲万物霉素标准品储备液100 μL，配制成400 μg·mL-1的溶液，依次用空白血清稀释成100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.562 5 μg·mL-1的血清标本，同时稀释得低、中、高3种浓度的质控血清标本，使其浓度分别为3.125、25.000、50.000 μg·mL-1。

2　结果

2.1色谱分离结果

在“1.3.1”项色谱条件下，万古霉素与去甲万古霉素分离完全，血中内源性物质对测定结果无干扰，见图1。

2.2标准曲线

测定标准曲线样本，以去甲万古霉素/万古霉素的峰面积为纵坐标，样本浓度为横坐标进行线性回归。结果显示:去甲万古霉素与万古霉素均在1.562 5 ～100.000 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。去甲万古霉素的线性方程为:Y = 0.099 8 X – 0.056 7，r = 0.999 8；万古霉素的线性方程为:Y = 0.097 3X – 0.346，r = 0.996 4。根据标准曲线，本方法中去甲万古霉素与万古霉素的定量限均为1.562 5 μg·mL-1。

图1　万古霉素与去甲万古霉素血清色谱图1 –去甲万古霉素，2 –万古霉素Fig 1　HPLC chromatogram of vancomycin and norvancomycin in serum1 – norvancomycin; 2 – vancomycin

2.3方法回收率与精密度实验

分别测定低、中、高3个浓度水平的血清质控标本各5组，计算方法回收率和日内精密度（RSD）；连续测定5日，计算日间精密度。日内、日间精密度均小于7%，见表1。

表1　测定血清中万古霉素与去甲万古霉素的方法回收率、精密度结果. n = 5Tab 1　Results of the recovery rates and precision of vancomycin and norvancomycin in serum. n = 5

2.4稳定性实验

取低、中、高浓度各3个平行样品，按“1.3.2”项下处理后，将上清液在室温分别放置4、24、48 h后重复测定，计算变异系数（CV%）；将配置好的血清质控标本置于– 4 ℃冰箱分装保存，每隔1周复测1次，3个水平分别测3组平行样品，计算CV%。结果显示，去甲万古霉素和万古霉素的血清标本在上述情况下稳定性良好，测定值CV% ＜ 10%。

2.5临床应用

采用本方法为2013年1 – 10月本院及外来的61例重症感染患者进行万古霉素或去甲万古霉素的血药浓度监测，其中万古霉素57例，去甲万古霉素4例，万古霉素测定峰浓度共28例，谷浓度共29例，去甲万古霉素峰谷浓度各2例。由于去甲万古霉素监测较少，故此只对万古霉素监测结果进行分析，其中9例患者血清谷浓度低于10 μg·mL-1，17例患者谷浓度在10 ～ 20 µg·mL-1之间，只有3例大于20 µg·mL-1，根据《万古霉素临床应用中国专家共识（2011版）》，万古霉素血药谷浓度临床上应控制在10 ～ 20 µg·mL-1，严重感染患者血药谷浓度应控制在15 ～ 20 µg·mL-1，至少要保持在10 µg·mL-1以上，以免发生耐药。根据检测结果，并结合患者实际情况，对药物的用量做了适当调整。血药浓度监测结果说明万古霉素在患者中具有较大个体差异，对其进行血药浓度监测非常重要。

3　讨论

3.1前处理条件的优化

血样处理方法的选择直接影响HPLC的应用效果，万古霉素与去甲万古霉素血样处理方法常用的有固相萃取法和直接沉淀法，前者较为繁琐，后者较为简便、省时，但有些蛋白沉淀剂并不能达到理想效果。目前，关于万古霉素血药浓度的HPLC测定方法国内外均有报道[1-6]，考虑万古霉素和去甲万古霉素性质等各方面的因素，初步选择乙腈、甲醇、10%硫酸锌、20%硫酸锌、30%硫酸锌、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）常用沉淀提取剂进行前处理优化。结果显示，单从外观方面，乙腈、甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）净化效果较好，10%硫酸锌、20%硫酸锌、30%硫酸锌常温条件下离心后，会出现肉眼可见的浑浊，但是10%硫酸锌净化效果明显好于20%硫酸锌以及30%硫酸锌，故并非硫酸锌用量越多净化越好。从进样回收率方面，乙腈的回收率几乎为0，甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）在60%左右，而用硫酸锌净化的回收率均在90%以上，故选用硫酸锌做沉淀提取剂。

进一步研究硫酸锌与血清的比例，以达到最优进化效果。前处理体系为200 μL血清+ 200 μL内标+100 μL沉淀提取剂，故配制2%硫酸锌、5%硫酸锌、10%硫酸锌进行优化对比，结果显示5%的硫酸锌净化效果最好，回收率最高，即硫酸锌沉淀提取剂与血清的配比应为:每毫升血清需加入0.25 g的硫酸锌。由于各方法的前处理体系并不相同，故需要的蛋白沉淀剂剂量也不相同，检测者可根据所监测的血样，按照实际应用换算需要加入沉淀剂的量，不局限于本体系，还适用与各种体系，使检测者换算更方便，准确。

3.2万古霉素监测的必要性

不恰当的抗菌药物治疗方案不仅会延长患者住院时间，甚至使临床治疗丧失应有的效果，且容易诱导耐药菌的产生，而恰当的治疗方案除了选择正确的抗菌药物外，合适的剂量和给药间隔也至关重要[7]。有文献[9]报道预防用药的不合理比例明显高于治疗用药。本次监测57例万古霉素患者，单独使用万古霉素仅13例，联用一种抗感染药物21例，联用两种抗感染药物16例，联用三种抗感染药物7例；在所有与万古霉素联用的抗感染药物中，主要有美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮钠舒巴坦钠、头孢吡肟、利尿剂等，其中用于治疗用药为90.75%，预防用药为9.25%，用药相对合理。

应根据药代动力学个体化调整万古霉素的剂量和实现目标血药浓度监测。推荐通过血药谷浓度进行剂量调整，新生儿保持谷浓度在5 µg·mL-1以上，成人则推荐为15 ～ 20 µg·mL-1。国家卫生部《二、三级综合医院药学部门基本标准》（卫医政发[2010]99号）中，将血药浓度监测设备列为二级以上医院药剂科“至少应当配备”的基本设备之一。仅通过药品说明书和医师经验给药，很难使血药浓度达到目标范围，必须借助血药浓度监测来实施精细调控。综合患者的实际情况给出用药建议，减少不合理处方，降低不良反应的发生。

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Concentration determination of vancomycin and norvancomycin by HPLC as well as its clinical application

HUANG Xiao-hui, LIU Yan, ZHANG Jian(Department of Pharmacy, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective:To establish the HPLC method for fast, effective, simultaneous determination of vancomycin and norvancomycin in serum.Methods:The extract was separated by Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH = 3.2) (7.5∶92.5) with the fl ow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was set at 236 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 25 μL. Vancomycin and norvancomycin were used as the internal standard for each other.Results:For norvancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 98.5%, 102.2%, and 103.1% respectively. For vancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 96.2%, 100.8% and 103.5% respectively. The within-day RSD was less than 3.24%, and between-day RSD was less than 6.12%.Conclusion:The method was accurate, sensitive, simple, which was suitable for the therapeutic drug monitoring (TDM) and pharmacokinetic study of vancomycin as well as norvancomycin.

Vancomycin; Norvancomycin; HPLC

R917

A

1672 – 8157(2014)02 – 0092 – 03

2013-11-11

2014-01-14）

国家自然科学基金青年基金（81202598）；上海市高校青年教师培养资助基金（ZZjdyx13091）

张健，男，主任药师，硕士研究生导师，主要从事临床药学与临床药理工作。E-mail:zj_boss@126.com

黄晓会，女，药师，主要从事临床药理学工作。E-mail:huangdi456@126.com