羟基喜树碱联合甲氧胺对SHG44胶质瘤细胞增殖作用的影响

胡珏 王鸿 吕庆华 郑英 朱永坚 郑鸣之

·论著·

羟基喜树碱联合甲氧胺对SHG44胶质瘤细胞增殖作用的影响

胡珏 王鸿 吕庆华 郑英 朱永坚 郑鸣之★

目的观察羟基喜树碱（hydroxycamptothecin， HCPT）单独及与甲氧胺（methoxyamine，MX）联合用药在抑制神经胶质瘤（SHG44）胶质瘤细胞增殖过程中是否具有协同作用，以期减少HCPT用量，降低毒副反应，为HCPT联合MX应用于抗胶质瘤治疗提供理论支持。方法联合运用HCPT与碱基切除修复抑制剂MX，用MTT法、流式细胞等方法检测联合用药的体外抑瘤效果及可能的机制。结果HCPT联合甲氧胺能显著抑制SHG44胶质瘤细胞增殖，随着浓度增加和作用时间延长，其增殖抑制效应也随之增强。流式细胞检测结果表明，HCPT联合MX组凋亡细胞比例明显增多，但与单独HCPT用药组比较未见明显差异。结论HCPT联合MX对SHG44胶质瘤细胞具有显著增殖抑制作用，且具有明显剂量-时间依赖性。

羟基喜树碱 甲氧胺 协同作用 MTT

神经胶质瘤（SHG44）是最常见的颅内恶性肿瘤，手术不易全切，且化疗效果差。提高化疗效果的重要途径之一是寻找高效低毒的化疗增敏剂［1～3］。羟基喜树碱（hydroxycamptothecin， HCPT）是从珙桐科植物喜树中提取分离的生物碱，通过抑制DNA拓扑异构酶I（TopoI）来达到治疗恶性肿瘤的目的［4］。多位学者发现羟基喜树碱可诱导肿瘤细胞凋亡，但体内试验和临床效应不明显。甲氧胺（methoxyamine， MX）是碱基切除修复的小分子抑制剂。有报道甲氧胺可增强烷化剂和放疗的抗肿瘤效果［5］。作者自2009年10月至2012年10月以（SHG44）为模型，探讨羟基喜树碱联合甲氧胺对胶质瘤细胞增殖作用的影响及其可能的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 羟基喜树碱注射液（贵州汉方制药有限公司提供）；甲氧胺（Sigma公司，美国）；人脑胶质瘤细胞系SHG44购自上海细胞生物研究所；DEME高糖培养液（青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，GIBCO公司产品）；细胞周期测定试剂盒、流式细胞仪（Bection Dikinson公司产品）；CO2培养箱（Forma公司产品）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo Labsystems公司产品）。新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；二甲基亚砜（DMSO，上海生物工程有限公司产品）；噻唑蓝（MTT）。

1.2 仪器 细胞培养超净工作台；倒置显微镜；37℃、5%CO2恒温细胞培养箱；酶标仪；流式细胞仪。

2 方法

2.1 细胞培养 SHG44细胞株，在含有10 %胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基内，于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育，常规传代培养。

2.2 分组与药物作用 经预实验后，分组：（1）羟基喜树碱（HCPT）：6.25、25、50、100μg/ml。（2）甲氧胺（MX）：10、30、60、120mM。（3） 联合用药组（HCPT +MX）：合用比例1：1。制成细胞悬液，1×104/孔个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl。在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养1d。加入不同浓度药物的培养基，对照组只加细胞培养液不加药。每个剂量组均设3个平行孔，再入培养箱中于相同条件下孵育。

2.3 MTT比色分析 分别培养24h、48h、72h后，弃去培养液，加入含10%MTT（5mg/ml）的无血清液DMEM培养液，继续培养3h后吸去上清液，加入150 μl DMSO，震荡10 min，使所形成的MTT结晶物溶解。用酶联免疫检测仪于570 nm处测定每孔吸光度（A）值，计算生长抑制率。用直线回归方程计算药物对胶质瘤细胞的IC50值（肿瘤细胞生长抑制率达50 %时化疗药物浓度）。细胞增殖抑制率（%）=［1-（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）］×100%

2.4 流式细胞仪检测细胞周期 消化细胞制成悬液（2×105/ml），每孔加2ml培养于6孔板，24h后加入各处理因素，按设计条件继续培养。收集上清液，0.25%胰酶消化贴壁细胞，与上清液一起收集，水平离心机1000r/min离心8min，去上清液，用PBS洗1遍。70%乙醇固定，4℃过夜，离心去除乙醇，PBS清洗2次。加入100μLRNA酶（lmg/ml）37℃水浴30min，置冰上2min终止RNA酶消化。加入PI染液（150μl/ml）1m1，室温避光30min。流式细胞仪检测，每次计数1万个细胞。以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目，以上实验重复4次。

2.5 统计学分析 全部实验结果均来自至少3组平行实验，计量数据用（x±s）表示，组间差异性比较采用SPSS10.0软件进行分析，以One-Way ANOVA进行方差分析后，以Student-Newman-Keuls检验行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 羟基喜树碱联合甲氧胺对胶质瘤SHG44细胞株增殖的抑制作用 10mM的甲氧胺与不同浓度的羟基喜树碱合用，作用72 h后，显著增强羟基喜树碱对SHG 44细胞的抑制作用，羟基喜树碱单用时，IC50值为0.31mM，与10mM的甲氧胺合用时，IC50值为0.093mM，羟基喜树碱单用是合用的3.33倍。甲氧胺浓度升高时，其增强羟基喜树碱抑制作用更明显，与30mM甲氧胺合用时，IC50值为0.076mM，羟基喜树碱单用是合用的4.08倍。与60mM、120mM甲氧胺合用时，IC50值分别为0.056mM、0.0047mM。结果见表1。图1。

表1 羟基喜树碱联合甲氧胺对胶质瘤SHG44细胞株增殖的抑制作用［（x±s）n=6］

图1 羟基喜树碱联合甲氧胺对胶质瘤SHG44细胞株增殖的抑制作用

3.2 羟基喜树碱联合甲氧胺对胶质瘤SHG44细胞凋亡的影响 羟基喜树碱联合甲氧胺组和单独羟基喜树碱组细胞于药物作用48h和72h时出现了明显的凋亡，而且其凋亡率明显高于空白对照组，流式细胞仪检测DNA倍体含量较空白对照组出现明显的亚二倍体凋亡峰，即Ap峰（Fig2）。羟基喜树碱联合甲氧胺组细胞在作用48h和72h时的凋亡率稍高于单独羟基喜树碱组，但差异无统计学意义，图2，见表2。

图2 SHG44胶质瘤细胞凋亡的流式细胞仪检测注：A组为空白对照组；B组为单独羟基喜树碱组；C组为羟基喜树碱联合甲氧胺组；羟基喜树碱联合甲氧胺组和单独羟基喜树碱组细胞于药物作用48h和72h时DNA倍体含量较空白对照组出现明显的亚二倍体凋亡峰。

表2 三组SHG44胶质瘤细胞凋亡率的比较［（x±s）%］

4 讨论

与细胞死亡相关的DNA损伤程度因不同药物而异，对DNA损伤的监测可通过药物作用后细胞存活的情况来反映。由于抑制DNA碱基切除修复有可能协同增强化疗药的抗瘤活性［6］，在实验中，作者利用MTT试验，观察BER抑制剂甲氧胺联合羟基喜树碱对胶质瘤细胞增殖作用的影响。结果发现，甲氧胺与不同浓度羟基喜树碱合用，作用72h后，能显著增强羟基喜树碱对胶质瘤细胞株的抑制作用，且作用时间越长，浓度越大，其抑制作用越强，具有时间-剂量依赖性。而流式细胞实验的结果显示，羟基喜树碱单用或与甲氧胺联用，细胞凋亡比例上升，表明甲氧胺能增强羟基喜树碱对胶质瘤SHG44细胞造成的DNA损伤，诱导细胞凋亡，可能是其能增强羟基喜树碱抗肿瘤活性的机制之一。

DNA拓扑异构酶I（topoisomerase I，Topo I）是生物体内广泛存在的必需酶，参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核过程，是细胞生存的必需酶［7］。多种肿瘤细胞Topo I的含量远高于正常细胞，是选择性抗肿瘤药物的理想作用靶点。喜树碱（camptothecin，CPT）来源于我国特有的珙桐科植物喜树（camptotheca acuminate）。1985年，Hsiang等揭示了喜树碱抑制拓扑异构酶I（TopoI）新的作用机制［8］，逐渐成为世界性研究热点。喜树碱类药物导致细胞凋亡的直接原因是由于其S期细胞毒性，使细胞终止在G2期［9］。处于S期细胞DNA大量复制，与拓扑异构酶I抑制剂遭遇形成DNA复合体机会增多，从而使DNA断裂点增多导致对喜树碱类药物诱导的凋亡最为敏感，约比G1或G2期细胞敏感1000倍［10］。但是Topo I抑制剂单独用药疗效欠佳，且易产生耐药。由于Topo I抑制剂耐药细胞株多不对其他化疗药产生交叉耐药，故通过不同机制的化疗药物配伍，如与Topo II抑制剂、TAX、铂类、烷基抗癌药等联合应用可提高疗效并避免或减少耐药的产生［11］。

碱基切除修复（base excision repair，BER）途径可以消除和替换烷化剂及内源性自由基等活性化学物质引起的局限性核苷酸残基损伤。至少有25种不同的基因参与这一途径。碱基切除修复可能是增强化疗药抗肿瘤效果的潜在治疗靶点［12］。甲氧胺是一种碱基切除修复的小分子抑制剂［13］。Yan L［14］等的研究显示体外和人肿瘤异种移植模型中甲氧胺均能增强替莫唑胺的细胞毒作用。Liu L［15］等为改进患卵巢癌患者治疗方法，通过BER抑制剂甲氧胺和N-methypurine DNA glycosylase（MPG）的过度表达操纵DNA碱基切除修复途径，结果显示替莫唑胺和甲氧胺联合应用对没有较佳化疗方法的患者是不错的选择。迄今为止，尚无以DNA修复路径为靶点的药物进入临床。因此，BER抑制剂甲氧胺与化疗药物联用，可降低化疗药剂量，减少化疗药的毒副作用，同时克服其非特异性细胞毒作用，是极有前途的治疗方案。本研究的结果证实：（1）甲氧胺对羟基喜树碱治疗胶质瘤具有协同作用。（2）羟基喜树碱与甲氧胺协同作用具有时间、剂量依赖效应。（3）初步证明两者协同效应通过诱导肿瘤细胞凋亡实现。后续实验将集中在进一步阐明作用的分子机制。

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ObjectiveTo improve the glioma suppression effect of hydroxycamptothecin （HCPT）and reduce its side-effects by changing its pharmaceutical delivery form. To clarify whether a synergetic effect exists between HCPT and methoxyamine （MX）on the inhibition of glioma cell proliferation and provide theoretical basis for the further usage of HCPT in the treatment of glioma.MethodsMTT and flow cytometry （FCM） were applied to determine the growth inhibition effect of using HCPT alone or in combination with MX on SHG4 cell line.ResultsDifferent concentrations of HCPT and MX were used alone or in combination and this combination usage showed a higer inhibition rate than using HCPT or MX alone. FCM results showed more cells were stopped at the G2 phase in the HCPT + MX group. However， the difference was not statistically signif cant between HCPT + MX group and HCPT group.ConclusionHCPT could inhibit the proliferation of SHG44 cell and the combination of MX could increase this inhibitory effect on SHG44， suggesting a synergistic effect between HCPT and MX.

Hydroxycamptothecin Methoxyamine Synergy MTT

浙江省自然基金项目（Y2091211）；浙江省医药卫生科技项目（2009B004）；浙江省中医药科技计划项目（2009CA044，2007CA060）

310053 浙江医学高等专科学校（胡珏 王鸿 郑鸣之）

310000 浙江大学医学院附属第二医院（吕庆华 朱永坚）

310013 杭州 中国人民解放军第117医院（郑英）

*通讯作者