神经干细胞治疗甲基丙二酸血症继发脑损伤4例临床观察

杨 辉，屈素清，刘卫鹏，杜 侃，杨印祥，栾 佐

神经干细胞治疗甲基丙二酸血症继发脑损伤4例临床观察

杨 辉，屈素清，刘卫鹏，杜 侃，杨印祥，栾 佐

目的观察神经干细胞治疗甲基丙二酸血症继发脑损伤儿童的临床疗效。方法2008年4月—2010年10月在我院治疗的甲基丙二酸血症继发脑损伤儿童4例，所有患儿均在磁共振头皮定位下行侧脑室穿刺神经干细胞移植。移植后1个月对患儿综合评估，并随访至移植后6个月，对患儿行Gesell发育量表评估。结果4例中，3例在移植后1个月内出现大运动、精细动作、视听反应及智力反应等方面的进步；跟踪随访至移植后6个月，3例均持续出现不同程度进步。细胞治疗均未出现不可逆不良事件。结论神经干细胞治疗安全可靠，能在短时间改善甲基丙二酸血症继发脑损伤患儿的运动和智力表现，并能持续至移植后6个月。在维持基础对因治疗的前提下，为甲基丙二酸血症继发脑损伤患儿提供了新的治疗方法，但远期疗效有待进一步随访观察。

甲基丙二酸血症；脑损伤；细胞移植；神经干细胞

甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）是有机酸代谢病中最常见的一种疾病，属于常染色体隐性遗传，发病率高，危害大［1-2］。其致病主要原因是甲基丙二酰辅酶A变位酶或其腺苷钴胺的代谢缺陷所致。这使得体内甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等有机酸异常蓄积，造成脑、肝、肾等多组织器官受损［3］，其中对脑造成的损伤常常导致智力运动发育落后、抽搐、反复呕吐等神经系统症状。然而，目前针对MMA的治疗包括药物治疗、特殊饮食以及肝肾移植治疗，均不能阻止脑损伤的进展，对其引起神经系统损伤尚无有效疗法［4-5］。大量实验表明，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）在神经修复方面有着确切的疗效［6-8］。因此，本研究尝试对确诊为MMA且合并明确脑损伤的4例患儿进行侧脑室内NSCs移植，对治疗后患儿进行临床观察，并对此治疗的安全性及有效性进行评价和探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008年4月—2010年10月在我科住院治疗的4例MMA患儿资料，均为男性，年龄10个月至3岁3个月；确诊时年龄2个月至2岁10个月，移植治疗的时间为确诊后经常规治疗4～12个月。其中，2例为第2胎第2产，1例明确有家族史。4例均在北京大学第一医院行尿液气相色谱-质谱联用法及血液相串联质谱分析方法确诊为MMA。诊断后给予维生素B12、左卡尼汀、甜菜碱等治疗。移植前血尿甲基丙二酸控制稳定。3例移植前已行常规康复训练治疗，但均有明显的智力、运动发育落后，Gesell发育量表评估均为重度缺陷；同时，头颅MRI均提示脑损伤表现。4例移植前脑电图均为异常范围脑电图，背景节律均较慢；其中3例有明显的癫痫异常放电，2例有临床表现（表1）。

表1 4例MMA患儿移植前一般资料

确诊标准：根据患儿串联质谱分析检测血丙酰肉碱、气相色谱-质谱检测尿有机酸谱等检验资料及临床症状进行诊断；其中，血丙酰肉碱、丙酰肉碱／游离肉碱及丙酰肉碱／乙酰肉碱增高，尿甲基丙二酸、丙酸升高。

1.2 细胞获取与移植方式

1.2.1 细胞获取 取孕10～12周自然流产胚胎的前脑组织，所有胚胎均为自愿捐献并签署知情同意书，家族史、流行病史、遗传性疾病、染色体疾病及感染性疾病病原学筛查均无异常，且通过海军总医院伦理委员会的伦理审查。

无菌条件下将组织用机械分散法制备成细胞悬液，接种于达尔伯克改良伊格尔／F12培养基，添加表皮生长因子20 ng／mL、成纤维细胞生长因子10 ng／mL、白血病抑制因子1 ng／mL，培养至第l4天，获取生长旺盛的NSCs小集落，制成细胞悬液，台盼蓝拒染法计数活细胞量，移植前行细胞培养液污染检测和神经干细胞活性鉴定。

1.2.2 细胞移植 移植前患儿行血常规、凝血三项、免疫四项、血生化检验，心电图、胸片及脑电图检查，无手术禁忌。所有患儿均由其法定监护人签署移植治疗知情同意书。术前头部备皮及消毒，氯胺酮基础麻醉下，颅骨钻钻开颅骨，选择沿目内眦方向及外耳道假想连线方向进针；根据头颅MRI影像头皮定位，穿至右侧侧脑室前角后拔出针芯，见清亮脑脊液流出，后缓慢注射6.0×106／0.5 mL NSCs，注射完毕后拔针并压迫包扎术区。术后平躺48 h，监测生命体征。

1.3 移植后治疗 移植后给予脑循环治疗促进脑部血流循环，其余治疗同移植前。

1.4 疗效评估 对患儿进行移植前、移植后自身对照，记录移植前、移植后1个月及6个月内的变化，进行智力及运动功能评估，记录发育各功能区（大运动、精细运动、应物、应人、语言）进步情况，同时对移植后1、6个月的发育情况进行追踪随访分析。有效标准判断：①患儿运动、智力表现有所进步；②根据患儿家长观察及描述较移植前进步；③Gesell发育量表评估至少2个功能区进步大于3个月。

2 结果

2.1 移植疗效 移植前4例经维生素B12、左卡尼汀、甜茶碱等治疗，呕吐、精神委靡等酸中毒症状均已消失，基础疾病控制良好；但康复训练后仍有明显的智力及运动功能落后，进步缓慢。

4例中有3例于移植后1个月运动、智力出现改善。有的患儿精神及睡眠较移植前好转、注意力集中、听指令好转等，有的表现为眼神灵活、对亲人依恋、有主动表达意识、可提示家长二便、独坐时间延长、翻身灵活、双手精细动作好转、独站或扶走较移植前稳等（表2）。移植后6个月对4例进行了随访，其中1例失访，另3例在运动、语言及智力出现了飞跃性的进步。病例1智力及运动功能均较移植前有所进步，表现为独坐较移植前稳、可部分建立平衡、与家人有眼神交流、能手握笔乱画、语言较前增多、听智力好转、清晰指示二便、会打招呼。病例2移植后6个月随访时双手精细动作较前好转，可捏取小豆子，会说“不，爸爸，dada”，眼神注视好，唤名字有反应，但大运动仍落后于同龄儿童。病例4移植后6个月随访进步最为明显，表现能独立行走、体位转换自如、能捏取、自行喂食、能串珠、听懂指令、表达简单要求、会叫“爸爸、妈妈”、与家人能简单交流，而这些移植前均不能独立完成；后家长自行回院复诊，移植后2年运动功能仍有一定的进步，智力和语言进步不明显，独走稳，会跑、欠稳，双手可用勺子吃饭、略狼藉，会明确表达二便，认识日常用品，会唱数至5，语言较前增多，智力测试提示中度缺陷。病例3移植后2个月失访。移植后6个月随访患儿进行Gesell发育量表评估，月龄变化情况见表3。

表2 3例移植后1个月改善情况

表3 3例移植后6个月Gesell量表发育月龄变化情况（月）

2.2 移植的安全性 4例进行颅骨穿刺并侧脑室NSCs移植，均操作成功。1例术后当晚出现一过性发热，给予物理降温、协助饮水处理后体温降至正常。另有1例术后出现呕吐2次，当时测血压正常，无明显其他不适，考虑与原发病及手术应激相关，给予调整体位、补液对症处理后未再出现呕吐；术后第2天出现体温一过性升高，物理降温后未再复升。另外2例术后无明显不适。4例术后均未发生不可逆的不良反应。4例移植前及移植后1个月均要求进行视频脑电图检查。2例移植后1个月时复查视频脑电图，其中1例见癫痫放电较移植前有所减少，另1例无明显变化；另2例因患儿配合欠佳，家长拒绝复查。所有患儿移植后均无癫痫临床发作。

3 讨论

随着诊断技术的不断发展，如血串联质谱分析、尿液气相色谱-质谱联用分析以及酶学和基因诊断等，使越来越多儿童的智力及运动发育落后明确了病因。其中甲基丙二酸血症作为一种有机酸血症，因其缺乏甲基丙二酰辅酶A变位酶及腺苷钴胺，导致代谢产物堆积［9］，造成神经系统损伤；尤其早期发病的患儿，可能出现广泛的神经系统表现，包括小头畸形、脑积水、肌张力低下以及认知障碍、癫痫发作，预后欠佳，严重影响患儿的生活质量和总体预后［10］。研究表明，MMA可引起患儿脑发育的延迟及损伤，MRI可表现为脑外间隙增宽、胼胝体发育不良、脑白质容积减少、脑白质髓鞘化延迟、基底节损害等［11］。而本研究中4例移植前头颅MRI表现与之相符，均有不同程度的脑损伤表现，临床上也出现明显的智力及运动功能落后。目前，临床上主要为合并同型半胱氨酸血症和维生素B12无效型，而针对MMA的治疗主要有特殊饮食及药物治疗。因我国大部分MMA患儿为MMA合并同型半胱氨酸血症，一般无需特殊饮食，诊断明确后给予口服或肌内注射维生素B12、口服左卡尼汀及甜菜碱治疗，针对维生素B12有效型效果尚可带来一定进步；但对已造成的颅脑损伤不能逆转，且不能阻止其脑损伤的进展。维生素B12无效型预后更差，起病早，神经系统损伤更为严重，很多在1岁内夭折［12］。本研究中4例均合并同型半胱氨酸血症，4例诊断后经药物治疗，血尿代谢指标均已达正常水平，但智力及运动功能已明显落后，进行NSCs移植治疗前3例已行训练等辅助治疗，Gesell发育量表测定均提示各功能区重度缺陷。

因此，根据MMA对患儿神经系统损伤的严重性，且目前药物及饮食控制无特效治疗，使得不断寻求新的治疗方法和手段来改善患儿预后。NSCs在体内和体外的动物实验均已证明了其治疗神经损伤的巨大潜力，可用于各种神经系统疾病，如帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤、脑卒中、创伤性脑损伤及严重肢体缺血等治疗［13-16］。我科从2005年起开始了NSCs治疗儿童多种神经系统疾病的临床观察，并进行了相关的实验和研究，NSCs应用于新生儿中毒缺氧缺血性脑损伤、新生儿重度一氧化碳中毒、脑性瘫痪、广泛性发育障碍等疾病治疗，且结果提示有一定疗效［17-20］。在长期的临床观察中，对于神经伤残患儿，NSCs移植可在一定程度上对患儿的智力及运动功能有改善的作用。2005年美国食品和药物管理局批准开展人胎脑NSCs脑内移植治疗小儿Batten综合征，研究（NCT00337636）表明，该方法具有良好的安全性，移植细胞能植入并长期存活，提高生存率［21］。本研究针对已明确合并智力及运动发育落后的MMA患儿进行了NSCs脑内移植治疗，进行自身移植前、移植后对照，观察其神经修复作用及临床的改善。

目前，NSCs移植治疗神经伤残作用机制仍未明，可能包括NSCs的替代效应及因子效应。移植入体内的NSCs在受者体内进行增殖、迁移和分化，且刺激内源性NSCs动员起来，迁移到受损伤区域发挥作用；同时，NSCs及其分化的神经元及神经胶质细胞能够自分泌和旁分泌如神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、胰岛素生长因子1等，起到神经营养及促进神经再生的作用。本研究MMA患儿代谢产物堆积导致神经受损，移植入脑内的NSCs迁移分化并分泌神经营养因子起到神经修复作用，是其改善的可能原因。由于干细胞发挥疗效的机制更多认为是其因子效应，即使替代效应也多在移植后6个月左右完成。既往研究也提示1次干细胞治疗疗效多持续6个月左右［18-20］，本组病例4移植6个月后进步缓慢也证实这点。因此，本组研究未进行较长时间的随访，但对如何提高长期疗效是我们今后需要不断探索和改进的。总之，甲基丙二酸血症继发性脑损伤导致智力及运动发育落后，除对因治疗外，还应更加关注患儿的发育情况，如进行康复训练、营养神经及抗癫痫等治疗，在传统治疗效果欠佳的情况下，NSCs移植不失为治疗的另一种选择。

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Clinical observation of neural stem cells in treatment of 4 patients with methylmalonic acidemia secondary to brain injury

YANG Hui，QU Suqing，LIUWeipeng，DU Kan，YANG Yinxiang，LUAN Zuo

（Department of Pediatrics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo observe the neural stem cell therapeutic effectwithmethylmalonic acidemia（MMA）secondary to brain injury.MethodsFrom April2008 to October 2010，4 patients with methylmalonic acidemia secondary to brain injury admitted to our hospital.All the patients received the neural stem cell transplantation via ventricle puncture positioned by MRI，and all the patientswere given a follow-up at 1 month and 6 month after the transplantation with Gesell scales assessment.ResultsThree of the four patients got improvements inmotor and fine skills，visual and intellectual reactions after the transplantation within 1 month.In the following 6 months the continuing improvements could be observed after the transplantation among the 3 patients.Cell therapy did not appear irreversible adverse events.ConclusionNeural stem cell therapy is safe and reliable，it can improve the clinicalmanifestations in children with methylmalonic academia secondary to brain injury in a short time.The efficacy can sustain to 6 months after the transplantation.On the basis of the treatment for the cause，the neural stem cell transplantation provides a new method of treatment formethylmalonic acidemia secondary to brain injury.But the long-term effect needs a further followup observation.

Methylmalonic acidemia；Brain injury；Cell transplantation；Neural stem cells

R725.8；R45

B

2095-3097（2014）04-0212-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.04.006

2014-05-28 本文编辑：徐海琴）

科技部国际合作专项项目（2012DFA30880）

100048北京，海军总医院儿科（杨 辉，屈素清，刘卫鹏，杜 侃，杨印祥，栾 佐）

栾 佐，E-mail：luanzuo＠aliyun.com