伏立康唑在海水浸泡致低体温家兔体内的药代动力学变化研究

王 强，冯 博，张 沂，任婷麟

·航海医学与转化·

伏立康唑在海水浸泡致低体温家兔体内的药代动力学变化研究

王 强，冯 博，张 沂，任婷麟

目的研究低体温对伏立康唑药代动力学的影响。方法20只家兔随机均分为低体温组和对照组。低体温组采用（21±1）℃海水浸泡60min致低体温造模。给予2组兔单剂量伏立康唑（10 mg／kg），取血并监测体温，高效液相色谱法测定不同时间点伏立康唑血药浓度，3P97软件计算药代动力学参数。结果低体温组动物体温在浸泡过程中及出水后一段时间持续下降，在36 h后恢复正常（36.6±0.8）℃。伏立康唑在低体温组和对照组兔体内药代动力学发生变化，药物半衰期和清除率差异有统计学意义（P＜0.05），但达峰时间、药物浓度-时间曲线下面积（area under concentration-time curve，AUC0-t）或AUC0-∞差异无统计学意义（P＞0.05）。结论伏立康唑在海水浸泡致低体温家兔体内清除减慢。

伏立康唑；药代动力学；低体温

动物较长时间浸泡于海水中，可导致机体体温下降且在出水后维持相当长一段时间［1］。在低体温内环境下，机体的体液［2］、血流动力学［3］、血液生化、血气及脏器功能［4］等发生复杂的生理或病理变化，这些变化可能影响药物体内处理过程。研究显示，左氧氟沙星在人工海水浸泡致低体温比格犬体内半衰期变长、代谢趋缓［4］。

海洋中含有多种真菌，在我国海域主要有子囊菌属、担子菌属、酵母菌属等，包括多种条件致病菌。长期在船上生活、作业或者受伤落水，容易导致真菌感染［5］。伏立康唑（voriconazole，VOZ）是第二代三唑类抗真菌药，为临床一线口服抗真菌药物，具有抗菌谱广、生物利用度高、可通过血脑屏障等特点。对多种真菌具有良好的抗菌作用，临床上可用于治疗急、慢性深部真菌感染、侵袭性去霉菌病、新型隐球菌性脑膜炎、进行性有致命危险的免疫损害患者等［6］。本文拟建立家兔海水浸泡致低体温模型，探讨伏立康唑在其体内药代动力学变化，为伏立康唑在低体温机体中合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康中国大白兔20只，体质量（2.4±0.4）kg，由北京市兴隆实验动物养殖中心提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要试剂及仪器 美国Waters高效液相色谱仪（包括1525二元高压梯度泵、2487紫外检测器、STD3101-1柱温箱、在线脱气机、717自动进样器、Empower工作站）；MDFU52V超低温保存箱（日本，三洋公司）；KQ400KDE台式高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；X-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）；TG-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；VOZ，每片200 mg，批号121020，美国辉瑞公司；伏立康唑对照品，中国药品生物制品检定所，批号100862-200701；内标卡马西平，中国药品生物制品检定所，批号100142-201004；乙腈、甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；冰乙酸、三乙胺、正己烷与乙酸乙酯均为分析纯，氢氧化钠（sodium hydroxide，NaOH）为化学纯，均购于北京北化精细化学品有限责任公司；超纯水为超纯水器（Millii-Q plus，美国，Millipore公司）自制。

1.3 方法

1.3.1 人工海水配制 人工海水配制参照中国国家海洋局第三研究所海洋化学研究室提供的《我国东南沿海海水主要成分配方》配制，NaCl26.520、MgCl22.447、MgSO43.305、CaCl21.414、KCl 0.725、NaHCO30.202、NaBr 0.083 g／L，人工海水水温（21± 1）℃，渗透压（1 250～1 350）mmol／L，pH为8.20，相对密度1.05～1.06。

1.3.2 实验动物分组 全部实验在室温（25±2）℃下进行。家兔实验前禁食过夜，自由饮水。实验用前准确称重，随机分为对照组和低体温组（每组10只）。低体温组动物实验中将其固定于海水浸泡池中浸泡60 min降低体温。对照组兔在相同环境条件下，但不在海水中浸泡。

1.3.3 给药方案与取血时间 低体温组兔捞出测体温，擦干后与对照组兔同时按10mg／kg给予VOZ，分别于给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h取血，置于肝素锂管中，3 000 r／min离心5min，小心吸取上层血浆，于－70℃保存待测。

1.3.4 体温测量 所有兔在给药前及给药后1、2、4、6、12、24、36、48 h测量体温。低体温组增加浸泡前和浸泡30、60 min体温测量。

1.3.5 标准溶液的制备 精密称取VOZ标准品10.0 mg，置于10 mL干燥容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解至刻度得VOZ标准品储备液（1 mg／mL），－70℃冰箱内保存备用。同法精密称取内标卡马西平标准品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度得卡马西平标准品储备液（1 mg／mL）。2种储备液在使用时加甲醇稀释至质量浓度为20μg／mL。

1.3.6 血浆标本处理 取待测血浆标本0.5 mL，加入20μL卡马西平标准溶液（20μg／mL），涡旋混匀30 s；再加入100μL预先配好的0.8mol／LNaOH溶液，涡旋混匀30 s；加入乙酸乙酯-正己烷（3∶1）3.7 mL，涡旋3次，每次混匀3 min；末次涡旋后迅速3 000 r／min离心5 min，取上层液，氮气吹干；残渣用200μL流动相溶解、混匀，12 000 r／min离心3 min，取上清液20μL进样分析［7］。

1.3.7 色谱条件 色谱柱Symmetry C18（3.9 mm× 150 mm，5μm，美国，Waters公司），柱温35℃；流动相乙腈∶水∶冰醋酸∶三乙胺为39∶60∶0.1∶0.9；流速1.4 mL／min，检测波长256 nm；进样量20μL。色谱图见图1。

图1 VOZ高效液相色谱图

1.3.8 标准曲线制备 取兔给药前血浆0.5 mL，置于5mL具塞离心管中，加VOZ标准液配制为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 mg／L质量浓度样品。按血浆标本处理方法处理后进样。以VOZ质量浓度（X）为横坐标，VOZ与内标峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，得回归方程：Y＝0．768 8X－0.001 7，r＝0.999 6。线性范围为10～2 000 mg／L。最低质量浓度为10 mg／L。

1.3.9 精密度、回收率实验和样品稳定性实验 将给药前血浆配制成5、100、200 mg／L质量浓度样品，按血浆标本处理方法处理、测定，计算其日内和日间精密度（3 d内）。结果3个不同质量浓度样品的日内和日间精密度相对标准偏差均＜5%。

取兔空白血浆0.5 mL，分别置于5 mL的离心管，再精密配制成5、100、200 mg／L质量浓度的样品，按血浆标本处理方法操作，每一质量浓度进行5样本分析，用VOZ、卡马西平的峰面积与相同质量浓度标准溶液直接进样测得的VOZ、卡马西平的峰面积之比计算其绝对回收率。结果表明，3个不同质量浓度回收率分别为88.29%、90.05%和89.33%。取给药前兔血浆0.5 mL，分别置于5 mL的离心管，再精密配制成5、100、200 mg／L质量浓度的样品，在即时、－70℃冷冻保存7 d及28 d后各测定3次。结果3个不同质量浓度样品，在3个保存时间无明显变化。

2 结果

2.1 实验兔体温 对照组兔在整个药代动力学实验中体温未见明显变化，观测到最高体温（37.2± 0.3）℃，最低体温（36.8±0.2）℃。低体温组兔在浸入人工海水后体温迅速下降，最低达（29.5±2.6）℃，并在出水后继续下降至（26.4±4.1）℃，直到药代动力学实验36 h时体温为（36.6±0.8）℃接近正常（图2）。

图2 不同时间点兔体温变化（¯x±s）

2.2 药代动力学 2组兔给予VOZ后血药物浓度-时间变化见图3。经3P97软件拟合后主要动力学参数见表1。与对照组比较：低体温组VOZ的半衰期从（6.72±0.87）h增长为（9.95±1.79）h（P＜0.05）；对VOZ的药物清除率从（42.68±7.58）L／h明显下降至（24.95±10.36）L／h（P＜0.05）；Cmax及AUC0-t、AUC0-∞上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）；而tmax变化不大。

图3 药物浓度-时间曲线（¯x±s）

表1 主要药代动力学参数（¯x±s）

3 讨论

VOZ作为目前一线广谱抗真菌用药，能用于治疗侵袭性曲霉菌、对氟康唑耐药的念珠菌引起的严重侵袭性感染以及由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重感染。VOZ的药效严重受其血药浓度影响，但VOZ在人体内的代谢方式较复杂，常以非线性动力学的方式进行代谢。因此，临床上对VOZ的使用方式不尽一致，导致VOZ的不良反应报道上升［8］。同时，VOZ与免疫调节药他克莫司、抗生素如左氧氟沙星、三环类镇静药苯巴比妥等合用，这些药物能影响细胞色素（cytochrome，CY）P450酶功能，进而影响VOZ的体内过程。因此，研究影响VOZ体内过程的因素，对VOZ合理使用具有重要意义。

临床上，生物低体温状况并不少见，通常在意外和医疗过程中发生。意外常见于严寒、落水后海水浸泡、长时间水下或矿井作业（被困井下）、严重创伤等。如本实验中家兔在（21±1）℃的人工海水浸泡后体温迅速下降至（29.5±2.6）℃，并且在出水后一段时间内体温持续下降至（26.4±4.1）℃，说明长时间的海水浸泡可导致动物处于较严重的低体温状态。医疗过程低体温常见于体外循环心脏直视手术及某些药物如麻醉药、镇静催眠药诱发的低体温，大手术过程中由于暴露的器官较多，使机体散热增加；大量快速输液或输血可使体温下降；近年被临床关注、研究和应用的治疗性亚低温。低体温具有中枢神经细胞保护作用和缓解心肌缺血的作用，可减少有害的细胞内蛋白水解反应、血脑屏障受损，减少神经元的损伤、延缓或阻断缺血性细胞死亡的发生等［9-11］。但研究也发现，低体温可影响多种药物的体内过程，如导致芬太尼、吗啡和苯巴比妥等的半衰期延长、体内清除延迟［12-14］。本实验结果发现，VOZ在自制人工海水浸泡导致的持续低体温兔模型其半衰期延长、清除率降低，但生物利用度没有变化。说明单剂量VOZ在低体温兔体内代谢减慢，长期使用VOZ可能导致药物蓄积增加，不良反应增加。但临床使用时是否需要进行剂量校正，还需进一步临床血药浓度监测或群体药代动力学试验研究。

低体温对机体生理活动影响较大。在低体温状态下，体内多种酶、功能蛋白的活性及多种基因表达均会有显著变化，肝、肾等重要脏器可发生病理组织学改变［2，4］。而VOZ在体内主要经细胞色素P450酶系代谢，如CYP3A4、CYP2C9及CYP2C19等，其中主要是CYP2C19。CYP2C19的催化能力受多种因素影响，如药物、基因及环境突变等［15］。李向阳等［16］研究发现，在高原环境下（＞4 000 m）大鼠CYP2C19活性发生改变并影响其底物奥美拉唑的代谢。因此，VOZ在低体温组兔体内代谢改变，可能与CYP2C19或其他代谢酶在低体温内环境下活性或表达发生变化有关，但低体温引起CYP450酶活性发生改变的具体机制尚待进一步研究。同时，由于肝、肾脏器及全身血流动学在低体温时也会发生变化，同样可能影响VOZ的代谢清除。低体温导致VOZ在体清除减缓的具体机制，尚需进一步研究。

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Pharmacokinetics changes of voriconazole in seawater immersed hypothermic rabbits

WANGQiang1，FENG Bo2，ZHANG Yi1，REN Tingling1
（1.Department of Pharmacy，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Medical Information，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacokinetic changes of voriconazole（VOZ）in seawater immersed hypothermic rabbits.MethodsTwenty healthy rabbits were randomly assigned to two groups（n＝10）：hypothermic group and control group.Rabbits in hypothermic group were immersed into（21±1）℃seawater for 60 mins before administration.All the rabbits were administered a single oral dose of 10 mg／kg VOZ.The temperature and VOZ in plasma of the rabbits at different sampling time were determined.Pharmacokinetic parameterswere calculated by 3P97 software.ResultsThe temperature of hypothermic rabbitswere declined during and after the seawater immersion，and back to normal at36 h after immersion（36.6±0.8）℃.Pharmacokinetic of voriconazole was changed.Compared with rabbits in control group，half-life time（t1／2）and（clearances）CLs of hypothermia rabbits were significantly reduced（P＜0.05），but tmax，area under concentration-time curve（AUC0-t），and AUC0-∞had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionClearance of voriconazole in seawater immersed hypothermia rabbits slowed down.

Voriconazole（VOZ）；Pharmacokinetics；Hypothermia

R978.5

A

2095-3097（2014）04-0216-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.04.007

2014-02-11 本文编辑：徐海琴）

国家自然科学基金（81273598）

100048北京，海军总医院药剂科（王 强，张 沂，任婷麟），信息科（冯 博）

张 沂，E-mail：pharmacynavy＠126.com