刺参益生菌梅奇酵母C14 培养基及发酵条件的优化

李璐瑶，杜鑫，包鹏云，张丛尧，曹淑青，马悦欣

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连116023)

酵母通常被认为是蛋白质、核酸、维生素和多糖的良好来源［1-2］。海洋红酵母Rhodotorula sp.可以替代单胞藻进行刺参浮游幼体的培育［3］;德巴利酵母 Debaryomyces sp.MY3、克鲁维酵母Kluyveromyces sp.MY32、虫道酵母Ambrosiozyma sp.MY33 以不超过50%的比例替代球等鞭金藻Isochrysis galbana，对海湾扇贝Argopecten irradians 幼贝的生长和存活影响不大［4］;汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii HF1可提高鲈Dicentrarchus labrax 幼体的存活率［5］;沼泽生红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum 能够促进凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 的生长［6］;清酒假丝酵母Candida sake S165、汉逊德巴利酵母S8和热带假丝酵母Candida tropicalis S186是印度明对虾Fenneropenaeus indicus 有效的免疫增强剂［2，7］。

刺参Apostichopus japonicus是中国北方地区重要的海珍品养殖种类。由于养殖密度的迅速增加和不规范养殖，使刺参病害频发，严重制约了刺参养殖业的可持续发展［8-12］。使用益生菌防止刺参疾病发生是替代抗生素的有效方法之一。薛德林等［13］研究表明，当海洋胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa(浓度为1 ×1010CFU/mL)日投喂量为10 mL/m3(水体)时，试验组刺参幼体烂胃病的发病率显著低于对照组。从天然海域健康刺参肠道分离的梅奇酵母Metschnikowia sp.C14 体外可抑制刺参病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629和灿烂弧菌Vibrio splendidus NB13 的生长［14］。Liu等［15］将梅奇酵母C14 添加到刺参基础饵料中进行投喂试验，结果表明，C14 菌株可刺激幼参的免疫反应，提高其抗病力。有益酵母菌的传统培养大多使用价格较高的葡萄糖、酵母膏和蛋白胨等培养基。本试验中，以成本低廉且适用于工业生产的糖蜜、豆粕粉和玉米粉为营养要素，优化梅奇酵母C14 的培养基与培养条件，旨在为该菌株的工业化发酵生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株梅奇酵母C14 从健康刺参肠道分离获得［14-15］。

培养基为种子培养基(YPD)，其包含蛋白胨20 g、酵母粉10 g、葡萄糖20 g、陈海水1000 mL，自然pH。

发酵培养基包含豆粕粉70 g、玉米粉50 g、糖蜜50 g、陈海水1000 mL，pH 为5。豆粕粉和玉米粉与一定量的海水搅拌均匀后于60 ℃水浴中静置1 h［16］。糖蜜的处理参考文献［17］中的方法。

1.2 方法

1.2.1 培养基的优化 将梅奇酵母C14 于YPD 斜面活化后，接入5 mL 液体种子培养基中，于25 ℃下摇床培养(150 r/min)20 h，再将其以4%的接种量接入盛有25 mL 发酵培养基的三角瓶(250 mL，下同)中，25 ℃下摇床培养(150 r/min)24 h，用血球计数板计数酵母菌总数［18］。

(1)单因素试验。在发酵培养基中添加50、60、70、80、90 g/L 共5 个浓度的豆粕粉(每一浓度设3 个平行，下同)，选择其最优质量浓度;在豆粕粉最优质量浓度基础上改变玉米粉含量为30、40、50、60、70 g/L 共5 个浓度，选择其最优质量浓度;在豆粕粉和玉米粉最优质量浓度基础上改变糖蜜含量为30、40、50、60、70 g/L 共5 个浓度，选择其最优质量浓度。

(2)正交试验。根据单因素试验结果，选择豆粕粉、玉米粉、糖蜜和pH 进行4 因素3 水平L9(34)的正交试验(表1)，共9 个处理组，每组设3 个平行，测定不同处理组酵母菌的生长情况。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of a orthogonal test

1.2.2 发酵条件的优化在正交试验优化后的培养基基础上，进行梅奇酵母C14 发酵条件的优化。种子液制备同“1.2.1”。

(1)温度对C14 菌株生长的影响。将液体种子以4%接种量接入25 mL 发酵培养基中，分别于20、25、30 ℃(每一温度设3 个平行)下摇床培养(150 r/min)24 h，计数酵母菌总数，确定该菌株的最适生长温度。

(2)摇瓶转速对C14 菌株生长的影响。将液体种子以4%接种量接入25 mL 发酵培养基中，在最适温度下分别以120、150、180、210 r/min(每一转速设3 个平行)摇床培养24 h，计数酵母菌总数，确定最适摇瓶转速。

(3)接种量对C14 菌株生长的影响。将液体种子以2%、3%、4%、5%和6%的接种量(每一接种量设3 个平行)接入25 mL 发酵培养基中，于最适温度和摇瓶转速条件下摇床培养24 h，计数酵母菌总数，确定最适接种量。

(4)装液量对C14 菌株生长的影响。将液体种子以最适接种量接入15、25、35 mL 发酵培养基(每一装液量设3 个平行)中，于最适温度和摇瓶转速条件下摇床培养24 h，计数酵母菌总数，确定最适装液量。

1.2.3 梅奇酵母C14 生长曲线的测定 将液体种子以最适接种量接入装有最适装液量的优化发酵培养基中，在最适摇瓶转速和温度条件下培养，每隔4 h 计数酵母菌总数。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 16.0 软件进行单因素方差分析和Duncan 多重比较，显著性水平设为0.05。描述性统计值用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1 单因素试验 不同质量浓度的豆粕粉、玉米粉和糖蜜对C14 菌株生长的影响如图1所示。发酵液中C14 菌密度随着豆粕粉、玉米粉和糖蜜质量浓度的升高均呈先上升后下降的趋势。从图1可见:当豆粕粉质量浓度为70 g/L 时，C14 菌密度最高，且显著高于其他浓度组(P＜0.05);不同玉米粉质量浓度对C14 菌株生长没有显著影响(P＞0.05)，当玉米粉质量浓度为50 g/L 时，C14 菌密度稍高;当糖蜜质量浓度为60 g/L 时，C14 菌密度最高(8.75 ×108cells/mL)，且显著高于其他浓度组(P＜0.05)。

2.1.2 正交试验在单因素试验结果的基础上设计豆粕粉质量浓度、玉米粉质量浓度、糖蜜质量浓度和pH 值4 因素3 水平的正交试验(表2)。从表2可见，影响C14 菌株生长的主次因素顺序为豆粕粉＞糖蜜＞pH ＞玉米粉。方差分析结果表明(表3)，A、D 因素对C14 菌株生长的影响均达到极显著水平，C 因素对C14 菌株生长的影响达到显著水平。因此，C14 菌株生长的最优培养基配方组合为A2B1C2D3，即70 g/L 豆粕粉，40 g/L 玉米粉，60 g/L 糖蜜，pH 为6，培养24 h 时的C14 菌密度达1.09 ×109cells/mL。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 温度对C14 菌株生长的影响 温度对C14菌株生长有显著影响，当温度为25 ℃时，C14 菌密度最高，且显著高于其他温度组(P＜0.05)(图2)。因此，在本试验条件下，确定最佳发酵温度为25 ℃。

图1 豆粕粉、玉米粉、糖蜜对C14 菌株生长的影响Fig.1 Effect of soybean meal，corn mealon，and molasses on growth of strain C14

表2 C14 菌株生长的正交试验设计方案及试验结果Tab.2 The growth of strain C14 and design in the orthogonal experiments

2.2.2 转速对C14 菌株生长的影响 随着摇瓶转速的增大，C14 菌密度显著提高，但进一步提高摇床转速，C14 菌密度则开始逐渐下降，当摇瓶转速为180 r/min 时，C14 菌密度达到最高，且显著高于其他摇瓶转速组(P＜0.05)(图2)。因此，在本试验条件下，确定最佳摇瓶转速为180 r/min。

2.2.3 接种量对C14 菌株生长的影响 接种量对C14 菌株生长有显著影响，当接种量为3%、4%时，C14 菌密度均较高，且显著高于其他接种量组(P＜0.05)，当接种量超过5%时，菌株的生长受到抑制(图2)。因此，在本试验条件下，从经济效益考虑，确定最佳接种量为3%。

表3 试验方差分析结果Tab.3 The results of ANOVA

2.2.4 装液量对C14 菌株生长的影响 C14 菌株的生长随装液量的增加而增加，当装液量为25 mL时，C14 菌密度最高，且显著高于其他装液量组(P＜0.05)，当装液量超过25 mL 时，菌株的生长反而受到抑制(图2)。因此，在本试验条件下，确定最佳装液量为25 mL。

2.3 C14 菌株的生长曲线

由图3可知，当培养时间为0 ～8 h 时C14 菌体生长缓慢，8 ～24 h 时菌体密度呈指数增加，28 h 时菌体密度最高(1.26 ×109cells/mL)。因此，在本试验条件下，确定最佳培养时间为28 h。

图2 培养温度、转速、接种量、装液量对C14 菌株生长的影响Fig.2 Effect of temperature，shaking speed，inoculum ratio，and medium volume on growth of strain C14

图3 C14 菌株的生长曲线Fig.3 Growth curve of strain C14

3 讨论

豆粕粉中蛋白质含量超过40%，且富含多种氨基酸。豆粕为工业生产枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 发酵培养基配方中的最佳氮源［19］。玉米浆含有丰富的氨基酸、还原糖、磷、微量元素和生长素，很容易被微生物吸收利用。玉米浆对水产用益生菌地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis D1 的生长有促进作用，适宜添加量为1.5%［20］。糖蜜是制糖工业的主要副产品，含丰富的糖类、氨基酸、有机酸、维生素、无机盐和色素等，是发酵工业中常用的廉价原料。海洋红酵母可利用糖蜜作为其生长较适宜的碳源［21］。本试验中，培养基中含豆粕粉70 g/L、玉米粉40 g/L、糖蜜60 g/L，有利于C14菌株的生长，培养24 h 后获得的菌密度(1.09 ×109cells/mL)远高于胶红酵母HN -3在葡萄糖、蛋白胨和酵母膏组成的优化培养基中生长48 h 的菌密度(4.80 ×107cells/mL)［22］。

本试验中，C14 菌株生长的最适温度为25 ℃，温度偏低可能与菌株来源有关。刺参通常生活在低温环境中，其体内的酵母菌为适应其生存环境而形成与陆地酵母菌不同的生活习性。当摇瓶转速为180 r/min 时，C14 菌株的生物量最高，可能是低转速使三角瓶内溶解氧含量减少，而高转速又导致瓶中的剪切应力增大，转速过高或过低时均使菌体生长缓慢。接种量与菌株的生长周期有关，接种量低，延滞期长，发酵周期延长;接种量高，菌体对营养成分的竞争力过大，菌体因营养不足而死亡，C14 菌株生长的最适接种量为3%。装液量可反映摇瓶内溶解氧含量的多少，装液量少，瓶内溶解氧含量多;装液量多时可导致供氧不足，影响菌体的生长，C14菌株生长的最适装液量为25 mL。梁晓华等［23］研究表明，250 mL 三角瓶中培养基的装液量为10 mL 时最有利于海洋红酵母Y2 的生长。本试验中，在优化的培养基和发酵条件下培养，C14 菌株的最大菌密度 为1.26 × 109cells/mL，高于海洋红酵母Rhodotorula benthica和Rhodotorula sp.RH1在优化的培养基(蔗糖/葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等)和发酵条件下培养获得的最大菌密度(9.70 ×108cells/mL、1.05×109cells/mL)［24-25］。因此，以豆粕粉、玉米粉和糖蜜廉价原料组成的培养基有利于C14菌株的生长。本试验结果可为刺参内源益生菌的工业化生产提供参考依据。

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