羟基喜树碱10，20位双取代衍生物的合成及活性评价

郭 娜，江 都，温少鹏，滕玉鸥

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

羟基喜树碱10，20位双取代衍生物的合成及活性评价

郭 娜，江 都，温少鹏，滕玉鸥

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

根据喜树碱类药物的构效关系和前药设计理念，设计和合成了一系列新的10，20位双氨基甲酸酯取代的羟基喜树碱衍生物，且均为新化合物．体外细胞活性测试结果表明：这些化合物的细胞毒作用比喜树碱明显降低，可作为前药先导物进行更深入研究．

喜树碱；抗肿瘤；合成

喜树碱和羟基喜树碱是从喜树中分得的微量生物碱类化合物[1]，对多种肿瘤具有明显的抑制作用，其作用靶点是拓扑异构酶I(TopoI)．喜树碱和羟基喜树碱具有较强毒副作用，容易出现不良反应，同时溶解性差，因此国内外研究者一直致力于寻找高效低毒的喜树碱衍生物，希望可以使药物选择性地分布于肿瘤部位，从而减少对正常细胞的毒性，或者因安全性提高使得用药量以及用药次数增加[2–3]．达到上述目的的方法之一是以前药的形式将药物制作成相对非毒性的制剂，待药物到达肿瘤部位时再被激活生成活性形式．

喜树碱常见的另一问题是其20位羟基内酯的不稳定性，在中性至碱性条件下容易水解开环成为非活性的羧酸盐．已有构效关系表明，内酯环与20位裸露的羟基是该类化合物抗肿瘤活性所必需的结构特征，将20位羟基衍生化后会导致活性下降，但同时内酯环的稳定性增加[4]，这是因为20位羟基可以与内酯的羰基基团形成分子内氢键，加速内酯的水解，而20位衍生化后破坏了此氢键作用，从而使内酯结构稳定．因此，20位进行适当的衍生化是制备喜树碱前药最普遍的方法[5–7]．最常见的衍生化是将20位羟基成酯[8–9]，但酯基在生理pH条件下容易水解，同时体内的多种水解酶也可水解酯基，选择性差，因此不是制备前药的理想基团．

2004年，Pessah等[10]报道了一系列喜树碱20位氨基碳酸酯连接桥连接的衍生物，该连接桥可被青霉素G酰化酶或催化抗体38C2选择性去除，释放出原药．因此，该连接桥在前药研究中具有较好的应用前景，本文研究也正是采用了氨基甲酸酯这一连接桥．

由于羟基喜树碱比喜树碱毒性稍小，抗瘤谱更

广，因此本文选择羟基喜树碱为原药，在其10位、20位同时以氨基甲酸酯为连接桥连接不同的亲水含氮基团，目的是通过对羟基喜树碱双取代的修饰在形成前药的同时获得比20位单取代衍生物更好的水溶性.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

羟基喜树碱，化学纯，上海龙翔医药科技有限公司；对硝基氯甲酸苯酯等试剂，化学纯，国药化学试剂有限公司．

6120型高效液相–质谱联用仪(LC-MS)，安捷伦科技有限公司；AV–400型核磁共振仪，布鲁克光谱仪器公司．

1.2 合成方法

羟基喜树碱的10位、20位均有羟基官能团，但反应活性不同，10位羟基的反应活性高于20位，控制反应条件和试剂当量可以选择性地在10位发生反应，在增加试剂当量或反应条件剧烈的情况下可以得到10，20位双取代的产物．据此，设计了一条简便易行的合成路线合成目标化合物，见图1．

1.2.1 中间体的合成

取5,g(13.72,mmol)10–羟基喜树碱溶于500,mL无水二氯甲烷(DCM)中，于冰浴下加入16.77,g (137.2,mmol)4–二甲氨基吡啶(DMAP)，再加入16.6,g(82.34,mmol)对硝基氯甲酸苯酯，冰浴下搅拌15,min，在室温下反应10,h．TLC检测反应完全后，用300,mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，加入乙醚使产物析出，过滤，干燥，得8.1,g 10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜树碱，即化合物1．

1.2.2 目标产物的合成

取0.5,g(0.72,mmol)10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜树碱(化合物1)溶于3,mL无水二甲基甲酰胺(DMF)，冰浴下加入0.22,mL(2.88,mmol)正丙胺，搅拌．TLC监测反应完全后，向反应混合物中加入15,mL饱和氯化钠水溶液，用25,mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝175∶1，200目硅胶柱层析纯化，得0.19,g固体化合物2．

化合物3—化合物6的合成方法与化合物2相同，只是含氮试剂分别为正丁胺、二乙胺、四氢吡咯和吗啉．

1.3 活性测试

采用MTT法检测目标化合物(化合物2—化合物6)和中间体(化合物1)对HepG2(人肝癌细胞)、K562(人白血病细胞)和HT-29(结肠癌细胞)3种肿瘤细胞的生长抑制活性．

2 结果与讨论

2.1 化合物的表征数据

2.1.1 化合物1

ESI-MS(m/z)：693.4[M–H]-.1H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.955～0.991(m，3,H)，2.249～2.329 (m，2,H)，5.338(s，2,H)，5.569(d，J＝6.0,Hz，2,H)，7.293(s，1,H)，7.529(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.769(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.971～8.001(m，1,H)，8.215(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.278～8.321(m，3,H)，8.395(d，J＝9.2,Hz，2,H)，8.754(s，1,H).

2.1.2 化合物2

ESI-MS(m/z)：533.6[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.810(m，3,H)，0.845～0.935 (m，6,H)，1.332～1.386(m，2,H)，1.497～1.551(m，2,H)，2.058～2.128(m，2,H)，2.828～2.891(m，2,H)，3.056～3.105(m，2,H)，5.305(s，2,H)，5.436(d，J＝3.2,Hz，2,H)，7.024(s，1,H)，7.629～7.657(m，1,H)，7.764～7.792(m，1,H)，7.891(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.979～8.007(m，1,H)，8.175(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.662(s，1,H).

2.1.3 化合物3

ESI-MS(m/z)：561.3[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.815(m，3,H)，0.891～0.937 (m，6,H)，1.2～1.251(m，2,H)，1.294～1.383(m，4,H)，1.460～1.515(m，2,H)，2.052～2.123(m，2,H)，2.890～2.905(m，2,H)，3.091～3.140(m，2,H)，5.307(d，J＝3.2,Hz，2,H)，5.435(d，J＝2.4,Hz，2,H)，7.021(s，1,H)，7.626～7.654(m，1,H)，7.739～7.767 (m，1,H)，7.885(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.948～7.976 (m，1,H)，8.164(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.66(s，1,H). 2.1.4 化合物4

ESI-MS(m/z)：561.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.973～1.010(m，3,H)，1.063～1.098 (m，3,H)，1.237～1.271(m，4,H)，1.306～1.374(m，6,H)，2.104～2.157(m，1,H)，2.241～2.312(m，1,H)，3.209～3.262(m，2,H)，3.399～3.577(m，6,H)，5.270(d，J＝6.0,Hz，2,H)，5.398(m，1,H)，5.676(d，J＝13.6,Hz，1,H)，7.357(s，1,H)，7.655～7.738(m，1,H)，8.274(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.350(s，1,H).

2.1.5 化合物5

ESI-MS(m/z)：557.5[M–H]-.1,H NMR(CDCl3， 400,MHz)，δ：0.958～0.995(m，3,H)，1.846～1.896(m，2,H)，1.946～2.045(m，6,H)，2.104～2.158(m，1,H)，2.269～2.323(m，1,H)，3.23～3.275(m，1,H)，3.353～3.397(m，1,H)，3.522～3.555(m，2,H)，3.617～3.663(m，4,H)，5.206～5.318(m，2,H)，5.407(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.67(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.343(s，1,H)，7.649(m，1,H)，7.758(d，J＝2.0,Hz，1,H)，8.248(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.343(s，1,H).

2.1.6 化合物6

ESI-MS(m/z)：589.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.969～1.006(m，3,H)，2.108～2.319(m，2,H)，3.345～3.452(m，2,H)，3.485(s，4,H)，3.644(s，4,H)，3.765～3.813(m，6,H)，5.286(t，J＝5.6,Hz，2,H)，5.406(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.683(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.303(s，1,H)，7.657(m，1,H)，7.734(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.263(d，J＝8.8,Hz，1,H)，8.356(s，1,H).

2.2 活性测试结果

采用MTT法测定中间体(化合物1)和目标产物(化合物2—化合物6)的体外抑制肿瘤细胞生长活性，结果见表1．由表1可见：化合物1—化合物6的活性均显著低于喜树碱，这与20位的羟基为活性必需的结论是相符的，同时也说明这些化合物符合前药的基本要求；中间体的抑制活性高于其他化合物，可能是由于中间体的稳定性差，在测试体系中有部分已变回羟基喜树碱；化合物4—化合物6的体外活性的降低较为明显，因此初步判断它们更适合继续进行药理和药代动力学研究，例如动物急毒实验、动物肿瘤抑制效果评价等．

2.3 目标产物的脂水分配系数

在实验过程中，观察到目标产物在水和有机溶剂中的溶解性相对喜树碱和羟基喜树碱均有所改善.

使用Chemdraw Ultra 8.0软件对化合物2—化合物6的脂水分配系数(CLogP)进行了预测，结果见表2．可以看出：化合物2—化合物5的脂溶性明显增强，而化合物6的性质与喜树碱和羟基喜树碱相当．所有目标产物的CLogP均小于5，符合Lipinski五规则，可以预期该类化合物可能具有更好的理化性质．

3 结 语

本文在喜树碱类药物已有构效关系的基础上，选择上市药物伊立替康中的氨基甲酸酯连接桥设计和合成了一系列10，20位双取代的喜树碱类衍生物，该类化合物的脂溶性有所改善，同时体外活性测试结果表明这些衍生物细胞毒作用明显降低，可作为前药先导物进一步研究．

［1］ Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al. Plant Antitumor Agents I. The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from camptotheca acuminata[J]. Journal of the American Chemistry Society，1966，88：3888–3890.

［2］ Wrasidlo W，Schroder，U，Bernt K，et al. Synthesis，hydrolytic activation and cytotoxicity of etoposide prodrugs[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2002，12(4)：557–560.

［3］ Schroeder U，Bernt K M，Lange B，et al. Hydrolytically activated etoposide prodrugs inhibit MDR-1 function and eradicate established MR-1 multidrug-resistant T-cell leukemia[J]. Blood，2003，102(1)：246–253.

［4］ Zhao H，Lee C，Sai P，et al. 20-O-acylcamptothecin derivatives：Evidence for lactone stabilization[J]. Journal of Organic Chemistry，2000，65(15)：4601–4606.

［5］ Leu Y L，Roffler S R，Chern J W. Design and synthesis of water-soluble glucuronide derivatives of camptothecin for cancer prodrug monotherapy and antibody-directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)[J]. Journal of Medicinal Chemistry，1999，42(18)：3623–3628.

［6］ Wen H，Shi D，Li Y. Glutathione-mediated drug release from camptothecin-conjugated prodrug nanomicelles based on PEG-polypeptide[J]. Journal of Controlled Release，2013，172(1)：e38–e39.

［7］ Xu Z G，Wang D D，Xu S，et al. Preparation of a camptothecin prodrug with glutathione-responsive disulfide linker for anticancer drug delivery[J]. Chemistry-An Asian Journal，2014，9(1)：199–205.

［8］ Greenwald R B，Pendri A，Conover C，et al. Drug delivery systems. 2. Camptothecin 20-O-poly(ethylene glycol)ester transport forms[J]. Journal of Medicinal Chemistry，1996，39(10)：1938–1940.

［9］ Greenwald R B，Pendri A，Conover C D，et al. Camptothecin-20-PEG ester transport forms：The effect of spacer groups on antitumor activity[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，1998，6(5)：551–562.

［10］ Pessah N，Reznik M，Shamis M，et al. Bioactivation of carbamate-based 20(S)-camptothecin prodrugs[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，2004，12(8)：1859–1866.

责任编辑：常涛

Synthesis and Biological Evaluation of 10，20-Disubstituted Hydroxycamptothecin Derivatives

GUO Na，JIANG Du，WEN Shaopeng，TENG Yuou
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

According to the structure-activity relationship(SAR)of camptothecin and the concept of prodrug，a novel seires of 10，20-disubstituted camptothecin derivatives with a carbamate linker was designed and synthesized. Biological evaluation in vitro revealed that the cytotoxicity of these analogs was significantly reduced compared with camptothecin，which indicated that these compounds could be further investigated as lead prodrugs.

camptothecin；antitumor；synthesis

R914.5

A

1672-6510(2014)06-0007-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.002

2014–04–01；

2014–05–19

国家自然科学基金资助项目(81302649)；天津市自然科学基金资助项目(14JCQNJC13200)

郭 娜（1982—），女，河北人，助理研究员；通信作者：滕玉鸥，副教授，tyo201485@tust.edu.cn.