苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠降血糖作用机制的研究*

马春宇 于洪宇 王慧娇 耿丽晶 关洪全

苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠降血糖作用机制的研究*

马春宇1,2于洪宇2王慧娇2耿丽晶2关洪全1△

目的 探讨苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠的降血糖机制。方法取清洁级雄性SD大鼠60只，随机取8只作为正常对照组，其余的用高脂高糖饮食喂养8周后用小剂量链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射建2型糖尿病大鼠模型。将合格的糖尿病模型大鼠40只分为模型组、二双胍组和3个剂量（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）苦瓜总皂苷组，每组8只。二甲双胍组每天给予二甲双胍50 mg/kg，苦瓜总皂苷100组、200组和400组：分别每天给予100、200和400 mg/kg苦瓜总皂苷，灌胃8周后分别测定大鼠空腹血糖、胰岛素，同时留取胰岛、肝脏和骨骼肌，分别用电镜、糖原染色和Western blot的方法观察胰岛β细胞结构、肝糖原和骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达量。结果给药8周后，与模型组比较，各苦瓜总皂苷组大鼠的空腹血糖和胰岛素值均显著降低，而骨骼肌GLUT4表达量显著增高，胰岛素分泌颗粒显著增加，肝脏糖原颗粒数量也明显增加。结论苦瓜总皂苷有降血糖作用，其机制主要包括促进肝糖原合成、抑制肝糖原分解以及通过外周组织GLUT4表达增强进而增加胰岛素敏感性等。

苦瓜；糖尿病，2型；血糖；胰岛素；葡萄糖转运体4型；苦瓜总皂苷

2型糖尿是发病率和死亡率最高的三大慢性疾病之一，且发病率仍逐年上升，在中国尤为明显[1]。糖尿病后期引发的多种并发症是患者致残和致死的主要原因，而高血糖及血糖波动是发生并发症的重要因素，故平稳降血糖是糖尿病治疗的首要任务。中药具有不良反应小、作用持久及临床疗效良好等优点，在糖尿病及其并发症的治疗上具有广阔的应用前景，尤其单味中药治疗糖尿病日益引起国内外学者的关注。

近年来，苦瓜已成为国内外众多学者的研究热点，其中研究最多的是苦瓜粗提物的作用。苦瓜粗提物的主要成分为苦瓜皂苷，许多研究都证明了苦瓜总皂苷对2型糖尿病动物有降血糖作用[2-3]。本研究通过建立2型糖尿病大鼠模型，采用苦瓜总皂苷对其治疗，观察苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠的血清指标、胰岛细胞形态、肝糖原和骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表达的影响，从而探讨其降糖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 清洁级雄性SD大鼠60只，体质量200～240 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号SCXK2010-0001。高脂高糖饲料成分比例为标准饲料∶白糖∶猪油∶蛋黄＝60∶17∶20∶3，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及药品 STZ，美国Sigma公司；二甲双胍，山东东方福瑞达制药有限公司；糖原染色液试剂盒，南京建成科技有限公司；苦瓜总皂苷由辽宁医学院食品科学与工程学院提供，为棕褐色粉末，经高效液相色谱法测定苦瓜总皂苷含量为57.2%。胰岛素酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、Western blot用抗体均由RD公司国内分装。

1.3 主要实验仪器 7600-20型全自动生化分析仪，日本日立公司；安准血糖测试仪，三诺生物传感技术股份有限公司；DNM-9602G型酶标仪，上海；JEM-1200EX型透射电子显微镜，日本；JC303-4型电热恒温培养箱，上海；MP200A电子天平，上海；Axioimager A1型荧光显微镜，德国Zeiss公司；VCX105型超声波细胞破碎仪，美国；UVP凝胶成像分析系统，美国；3k15型低温高速离心机，德国Sigma公司。

1.4 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠分笼饲养，适应性普通饲料喂养1周，温度(20±2)℃，湿度(60±5)%。除对照组大鼠外均高脂高糖饲料喂养8周后禁食12 h，STZ溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH4.5)后，尾静脉注射STZ溶液25 mg/kg。72 h后测定血糖值，以空腹血糖≥11.1 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。

1.5 动物分组及给药 选合格的糖尿病模型大鼠40只，均分为5组，每组8只。模型组：不做任何处理；二甲双胍组：每天给予50 mg/kg二甲双胍；苦瓜总皂苷100组、200组和400组：分别每天给予100、200和400 mg/kg苦瓜总皂苷，均采用灌胃给药方式连续给药8周。另选取正常大鼠8只为对照组。

1.6 标本采集、处理及指标测定 给药8周末称质量，腹腔注射戊巴比妥钠(120 mg/kg)麻醉已禁食大鼠，取鼠尾血用血糖仪测定血糖值。仰卧式固定大鼠后开胸，用注射器从心尖取血4 mL装于促凝管中，离心后将血清装于EP管于-20℃保存，用ELISA法按照试剂盒说明书检测大鼠血清胰岛素，剩余血清送检测血糖。每组大鼠采血后，快速取肝脏、胰腺、大腿骨骼肌，分别剪取部分组织用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，标记后-80℃冰箱保存。用透射电镜观察胰腺胰岛β细胞，用过碘酸-希夫氏(PAS)染色观察肝脏组织中糖原的量，Western blot检测骨骼肌中GLUT4的表达量。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰岛素和骨骼肌GLUT4表达的影响 与对照组相比，模型组的空腹血糖、胰岛素均明显增加，而GLUT4表达量明显减少（P＜0.01）。给药8周后，与模型组比较，3个苦瓜总皂苷组和二甲双胍组大鼠的空腹血糖和胰岛素值均降低，而骨骼肌GLUT4表达量均升高(P＜0.01)。见表1、图1。

Table1 Comparison of the fasting blood glucose, insulin and the GLUT4 expression level in the different rat groups表1 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及骨骼肌GLUT4表达水平比较 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.01

组别对照组模型组二甲双胍组苦瓜总皂苷100组苦瓜总皂苷200组苦瓜总皂苷400组F空腹血糖(mmol/L) 4.88±1.02 16.63±3.18a7.28±1.75b10.16±1.84b8.14±1.56b7.41±1.78b42.728＊＊空腹血清胰岛素(mIU/L) 10.64±1.87 15.89±1.94a11.93±1.73b14.35±1.86b12.97±1.95b12.06±1.74b5.124＊＊GLUT4表达的相对灰度值1.08±0.11 0.38±0.04a1.23±0.09b1.01±0.09b1.36±0.12b1.81±0.25b126.017＊＊

2.2 苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞超微结构的影响 正常对照大鼠β细胞核呈卵圆形或圆形，胞质内有大量大小不一的分泌颗粒，颗粒内有大小不同的致密核芯，核芯与界膜之间有较宽的清亮间隙，见图2A。模型大鼠胰岛β细胞核固缩，核膜凹陷，分泌颗数量减少，空晕增宽，核芯缩小，有的界膜破裂，相互融合，见图2B。苦瓜总皂苷组和二甲双胍组相似，β细胞分泌颗粒数量较模型组增加，但仍少于对照组，分泌颗粒的核芯与界膜之间空晕较清晰。随苦瓜总皂苷剂量的增加分泌颗粒有增多的趋势，见图2C～F。

2.3 苦瓜总皂苷对肝脏糖原含量的影响 糖原在PAS染色后显色呈紫红色颗粒，对照组大鼠的肝脏细胞中紫红色糖原颗粒分布均匀；模型组大鼠肝脏中紫红色糖原颗粒含量明显较对照组大鼠少，分布不均，局部甚至消失。苦瓜总皂苷低剂量组和二甲双胍组肝脏糖原颗粒数量与模型组无明显差异，而苦瓜总皂苷200组、400组的肝脏糖原颗粒数量较模型组大鼠有所增加，而且分布均匀，苦瓜总皂苷400组的糖原颗粒分布接近对照组水平，见图3。

3 讨论

本研究用高脂高糖饮食结合小剂量STZ尾静脉注射的方法成功获得2型糖尿病大鼠模型，大鼠表现为高血糖、高胰岛素血症。通过8周的治疗可以证实苦瓜总皂苷能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖和血清胰岛素水平。随苦瓜总皂苷的剂量增加，血糖和胰岛素降低更加明显，400组的降糖作用与二甲双胍相当，说明苦瓜总皂苷的降糖作用是温和而持久的。

血糖水平的维持主要与胰岛β细胞功能、肝脏的糖原合成分解功能、外周组织对葡萄糖的利用等密切相关。GLUT4主要分布于胰岛素敏感细胞如肌肉细胞中，是将葡萄糖从血液转移到组织细胞中进行利用的主要蛋白。GLUT4表达量的多少可以反映出葡萄糖的利用程度。GLUT4表达量下降导致骨骼肌、心肌和脂肪组织对葡萄糖摄取利用减少是胰岛素抵抗的重要分子基础，是诱发2型糖尿病的原因之一[4]。本研究发现与正常对照组相比，模型组的GLUT4表达量明显降低，而二甲双胍组和苦瓜总皂苷组明显增加，增加幅度随苦瓜总皂苷的剂量而增加。结合血清胰岛素水平的降低，可以推测苦瓜总皂苷的降血糖作用之一是通过增加GLUT4的转运和数量而加速葡萄糖的利用，进而增加胰岛素的敏感性。GLUT4的表达增强是外周组织加强对葡萄糖利用的中心环节，很可能与磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）通路的增强有关。有研究发现苦瓜皂苷可以使细胞中的AMPK活性增强[5]，而AMPK通路的激活恰恰是胰岛素发挥作用的始动因素，进而增加GLUT4的表达和葡萄糖的摄取[6]。苦瓜皂苷除了使GLUT4表达增强之外，还能增加胰岛素转运受体底物的磷酸化速率[7]，也说明了苦瓜总皂苷的降血糖的重要机制之一就是提高外周组织对胰岛素的敏感性。

本研究通过透射电镜观察发现模型组大鼠的胰岛β细胞有明显的损伤，分泌颗粒数量减少，而苦瓜总皂苷的各治疗组大鼠胰岛β细胞形态有所修复，分泌颗粒数量有所增多。虽然胰岛β细胞分泌颗粒有所增加[8]，胰岛β细胞有所修复，但血清胰岛素水平却有所降低，说明苦瓜总皂苷有使外周组织对胰岛素的利用增强或有类胰岛素的作用，进而减轻了胰岛β细胞分泌胰岛素的负担，间接地起到了保护和修复胰岛β细胞的作用。苦瓜总皂苷可能只能修复未完全受损的胰岛β细胞，而对完全坏死的胰岛β细胞是没有再生和修复作用的。

通过肝糖原PAS染色发现，与对照组大鼠相比，模型组的糖原含量明显减低，而通过药物治疗后，肝糖原的含量均有所增加，其中苦瓜总皂苷治疗各组随其剂量的增加而增加，苦瓜总皂苷400 mg/kg剂量组的肝糖原含量与正常对照组相当，说明苦瓜总皂苷有增加肝糖原的作用。研究发现，胰岛素可以使糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3)磷酸化，进而抑制糖原合成酶的活性，而苦瓜总皂苷有类似胰岛素样结构可以阻止GSK-3的磷酸化，进而促进糖原的合成和抑制糖原的分解[9]。

综上，苦瓜总皂苷的降血糖机制可能是促进肝糖原的合成、抑制肝糖原的分解以及提高外周组织的胰岛素敏感性等。

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（2013-10-25收稿 2014-01-01修回）

（本文编辑 闫娟）

Hypoglycemic Mechanism of Total Saponins of Momordica Charantia in Type 2 Diabetes Mellitus Rats

MA Chunyu1,2,YU Hongyu2,WANG Huijiao2,GENG Lijing2,GUAN Hongquan1
1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning 110032，China;2 Liaoning Medical University

Objective To observe the hypoglycemic mechanism of total saponins of Momordica charantia(MC)in type 2 diabetes mellitus(DM)rats.MethodsAmong the selected 60 male Specific Pathogen Free(SPF)rats,8 were randomly chosen as control group,while others were fed with high fat and high glucose diet following streptozotocin injection from caudal vein 8 weeks after to construct type 2 DM models.After the DM models were successfully built,rats were then randomized into five groups:DM control group(n=8),the metformin group(n=8)and three groups of total saponins of MC with different dosage(n=8 in each group).The total saponins of MC groups include DM rats administrated with total saponins of MC 100,200,400 mg/(kg·d)for 8 weeks,the metformin group include DM rats administrated with metformin 50 mg/(kg·d) for 8 weeks.At the end of the experiment,the fasting blood glucose and insulin were examed.At the same time,a part of pancreas islet,liver and skeletal muscle were preserved.The pancreas islet structure,the hepatic glycogen and Glucose transporter 4(GLUT4)expression were observed by electron microscope,glycogen dyeing and immunoblot respectively.ResultsAfter 8 weeks treatment,compared to type 2 DM control group,fasting blood glucose and insulin values in MC groups were reduced more obviously.However,skeletal muscle GLUT4 expression level,insulin granules and hepatic glycogen increased obviously in MC groups.ConclusionTotal saponins of MC has hypoglycemic effect.It’s mechanisms maybe include promoting the hepatic glycogen synthesis,inhibiting the hepatic glycogen decomposition and promoting insulin sensitivity by increasing peripheral tissue’s GLUT4 expression.

momordica charantia；diabetes mellitus,type 2；blood glucose；insulin；glucose transporter type 4；total saponins of momordica charantia

R587.1，R285.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.010

*辽宁省教育厅资助项目（项目编号：L2012305）

1辽宁沈阳，辽宁中医药大学（邮编110032）；2辽宁锦州,辽宁医学院

△通讯作者 E-mail：hongquanguan@sina.com