补肾中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠 下丘脑Leptin的影响❋

王 剑，郑洪新，刘 研，张锦萍，刘剑辉，宋光熠，刘瑞辉

(1. 辽宁医药职业学院，沈阳 110101；2.辽宁省基础医学研究所，沈阳 110101； 3. 辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteopo-rosis,PMOP)多发于50～70岁绝经后妇女，是以骨量迅速丢失和骨组织微结构退行性变为特征的一种全身性代谢性骨病，骨强度降低、骨折危险性增加，严重威胁绝经后妇女的身体健康和生活质量[1]。目前PMOP发病机制尚不完全清楚，亦无特效防治方法。研究显示，瘦素(Leptin)可间接作用于中枢神经系统，促使其释放下丘脑源性成骨细胞抑制因子，作用于骨细胞而抑制骨形成[2]。临床实践表明，中医药防治PMOP具有较为理想的效果，但其疗效机理尚待进一步研究。本研究在中医“肾藏精生髓主骨”理论的指导下，以Leptin为效应指标，探讨去卵巢骨质疏松症大鼠下丘脑Leptin蛋白水平变化，以及补肾中药复方的疗效及其调节机制，为中医药防治PMOP提供科学的实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠共100只，雌性未曾交配，体质量(275±25)g，4～5月龄，由辽宁长生生物技术有限公司提供(辽宁省实验动物质量合格证号0004179)。

1.2 药品

补肾中药复方：由鹿茸(脱毛、冻干、粉碎，过80目筛)、淫羊藿(水提、浓缩，上大孔树脂，乙醇洗脱)、牡蛎(洗净，晒干，纳米技术粉碎，平均粒径780 nm)组成。西药对照：钙尔奇D(碳酸钙D3片，Wyeth惠氏制药有限公司，国药准字H10950029，批号1105243)。中药对照：骨疏康颗粒(方药组成：淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜子，辽宁康辰药业有限公司，国药准字Z20003255，批号111103)。

1.3 主要仪器

XR-36型双能X线骨密度仪(美国NORLAND公司)、电泳仪(BIO-RAD，PowerPac200，美国)、垂直板电泳装置(BIO-RAD，Mini-Protein III，美国)、Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)等。

1.4 主要试剂

羊抗Leptin多克隆抗体(一抗，美国santa cruz公司)、碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG(二抗，北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分组

动物7只用于预实验，余者完全随机分为6组：正常组(12只)、模型组(12只)、假手术组(12只)、补肾中药复方组(20只)、钙尔奇D组(18只)、骨疏康组(19只)。

2.2 模型建立及鉴定

2.2.1 骨质疏松症大鼠模型的建立 正常组除外，其余各组大鼠2%戊巴比妥钠腹腔注射(35 mg/kg体质量)麻醉，手术从腹部切除双侧卵巢，假手术组只行切口切开而不切除卵巢。

2.2.2 骨质疏松症大鼠模型的鉴定 目前国内外主要是通过检测骨密度来诊断骨质疏松，最常用的检测方法是双能X射线吸收测量法(DEXA)。我们应用XR-36型双能X线骨密度仪测定大鼠离体股骨骨密度来鉴定本实验骨质疏松症大鼠模型复制是否成功。

2.2.3 给药剂量与方法 大鼠等效剂量按成人用药量的6.3倍计算(成人体质量按60 kg计算)，给药容积0.5 ml/100 g体质量。正常组、模型组、假手术组给予等体积的生理盐水；补肾中药复方组(补肾中药复方)1.139 g·kg-1·d-1(鹿茸：0.8 g·kg-1·d-1，淫羊藿提取物0.076 g·kg-1·d-1，牡蛎0.263 g·kg-1·d-1)；钙尔奇D组(钙尔奇D)0.126 g钙·kg-1·d-1；骨疏康组(骨疏康颗粒) 2.1 g·kg-1·d-1。术后7 d开始，每日上午灌胃给药1次，连续12周。

2.3 标本采集与制备

2.3.1 股骨 取右后肢全股骨剔除肌肉、筋膜(保留骨膜)，生理盐水冲洗，医用纱布包裹，外包锡纸，-20℃冰箱冻存待测骨密度。

2.3.2 下丘脑 无菌取下丘脑，一半置于高压灭菌的空白EP管内，-70℃冰箱冻存，待做Western Blot。

2.4 观察指标与检测方法

2.4.1 双能X线骨密度仪检测离体股骨骨密度(BMD) 应用XR-36型双能X线骨密度仪进行大鼠离体股骨骨密度检测，应用仪器附带的“the Small Subject Scout Scan”软件进行数据分析。骨密度采用单位面积内的骨矿物质含量表示(g/cm2)。

2.4.2 Western Blot检测下丘脑Leptin蛋白水平 细胞裂解法提取大鼠下丘脑总蛋白，Lowry法蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳，硝酸纤维素膜转印，一抗、二抗孵育，酶显法显色。Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像系统成像，Scion Image软件分析蛋白电泳条带灰度值，以GAPDH作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值/ GAPDH条带灰度值来表示目标蛋白(Leptin)的相对水平。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组离体股骨骨密度比较

表1显示，灌胃过程中动物死亡5只，取材时共计88只。离体股骨骨密度检测统计结果显示，与正常组比较模型组明显降低(P<0.001)；与模型组比较，补肾中药复方组、骨疏康组明显升高(P<0.05)，钙尔奇D组虽有升高趋势但无统计学意义(P>0.05)。

3.2 各组下丘脑Leptin蛋白水平比较

图1表2显示，下丘脑Leptin蛋白水平检测统计结果显示，与正常组比较，模型组明显升高(P<0.01)；与模型组比较，补肾中药复方组明显降低(P<0.05)，钙尔奇D组、骨疏康组虽有降低趋势但无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠离体股骨骨密度

注：与正常组比较：***P<0.001；与模型组比较：△P<0.05

图1 下丘脑Leptin、GAPDH蛋白Western Blot条带注：A组：正常组；B组：模型组；C组：假手术组；D组： 补肾中药复方组；E组：钙尔奇D组；F组：骨疏康组

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01

4 讨论

PMOP患者骨密度降低导致骨脆性增加，容易发生骨折，严重威胁绝经后妇女的身体健康和生活质量，其发病机制和防治研究已成为妇女保健的重要课题。

中医理论认为“肾藏精生髓主骨。”《素问·上古天真论》：“女子七岁，肾气盛，齿更发长……四七筋骨坚，发长极，身体盛壮……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”，说明女子盛年之前，随年龄增长，肾中精气逐渐充盛、生髓养骨，骨逐渐强劲有力；盛年之后，随年龄增长，肾中精气逐渐衰减、髓减骨枯，骨逐渐痿弱无力，七七肾虚天癸竭，地道不通而绝经，肾虚精亏，骨髓生化乏源，骨失之滋养而导致骨质疏松。因此，PMOP的根本病机是肾虚，临床防治该病可选用补肾法。

瘦素(Leptin)由肥胖基因编码，白色脂肪细胞合成、分泌，是一种具有146个氨基酸的多肽类激素，其在骨代谢研究领域的作用正逐渐被重视[3、4]。现代医学研究发现，Leptin在中枢对骨代谢表现为负性调节作用，可间接作用于中枢神经系统，促使其释放下丘脑源性成骨细胞抑制因子，作用于骨细胞而抑制骨形成[2]。Wong等[5]研究发现，Leptin作用于下丘脑弓状核神经元细胞，降低神经肽Y mRNA的转录，通过成骨细胞上的神经肽Y受体抑制成骨细胞分化，降低骨密度。

关于下丘脑Leptin蛋白水平与PMOP发病机制的关系以及中药的相应调节机制，笔者尚未见到国内外文献报道。采用雌性大鼠双侧卵巢切除方法进行造模，是研究PMOP的经典模型[6]。本研究选用笔者导师郑洪新教授多年科研、临床实践的补肾中药复方(由“生精补髓、强筋健骨”之经典补肾中药鹿茸、补肾强筋健骨之传统补肾中药淫羊藿和补肾壮骨、滋阴潜阳之牡蛎组成，全方共奏补肾填精、益髓壮骨之功)作为实验因素，选用钙尔奇D(促进钙、磷在肠内的吸收，并促进骨骼的正常钙化)作为西药对照，选用首个治疗骨质疏松症的中药复方——骨疏康颗粒(补肾益气、活血壮骨)作为中药对照，以下丘脑Leptin蛋白水平作为效应指标，探讨PMOP的发病机制以及补肾中药复方的疗效机理。结果显示，模型组大鼠骨密度比正常组明显降低，说明本实验切除双侧卵巢复制PMOP大鼠模型成功。模型组大鼠下丘脑Leptin蛋白水平比正常组明显升高，负性调节骨代谢，抑制骨形成，降低骨密度。补肾中药复方明显降低模型大鼠下丘脑Leptin蛋白水平，增强骨形成，从而明显升高模型大鼠的骨密度，疗效显著，优于骨疏康颗粒。钙尔奇D虽可降低模型大鼠下丘脑Leptin蛋白水平，升高其骨密度，但均无统计学意义。因此，下丘脑Leptin蛋白水平升高可能是PMOP的发病机制之一；应用补肾中药复方，可明显降低下丘脑Leptin蛋白水平，对该病具有显著的防治效果，疗效优于骨疏康颗粒及钙尔奇D，故临床防治PMOP可选用补肾法。

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