LmbB2催化酪氨酸合成左旋多巴的工艺研究

马强强，赵广荣

(天津大学 化工学院制药工程系 系统生物工程教育部重点实验室 天津300072)

左旋多巴(L-DOPA)化学名为 β-3，4-二羟苯基-α-丙氨酸(3，4-2dihydroxylphenylalanine)(图 1)，又名3-羟基-L-酪氨酸。其作用机理为左旋多巴能通过血脑屏障，到达中枢神经系统，在脱羧酶的作用下，转变为多巴胺，进而发挥治疗帕金森综合症的作用［1］。目前左旋多巴的制备方法主要有化学合成，植物提取，生物酶催化以及微生物发酵。由于化学合成和植物提取方法具有一定的局限性。20世纪60年代末，国内外一些学者开始探索生物酶法合成左旋多巴。左旋多巴的生物合成常用的酶有两种，其一是酪氨酸酚解酶［2］，以邻苯二酚、丙酮酸和氨水为底物，催化形成;另外一种是一种羟化酶［3］，在酪氨酸的临位羟基上直接羟化，形成左旋多巴。

图1 左旋多巴Fig.1 L-DOPA

林可链霉菌中lmbB2基因编码的蛋白(LmbB2)具有酪氨酸酶的功能［4］，可催化L-酪氨酸生成左旋多巴。本研究是以林可链霉菌的lmbB2为目的基因，连入pCDFDuet-1载体中，构建了表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，合成了左旋多巴。并通过添加底物以及L-抗坏血酸，以提高左旋多巴的产量。

1 试验部分

1.1 实验材料

Streptomyces lincolnensis，大肠杆菌 Escherichia coli DH5a，E.coli BL21(DE3)，本实验室保存;表达载体pCDFDuet-1购于 Novagen公司;pEASY-T3载体购于北京全式金生物技术有限公司;左旋多巴购于上海晶纯实业有限公司;酪氨酸购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 载体构建

在MS固体培养基上活化林可链霉菌，转接在YEME培养基中，36 h后收获菌丝体。根据链霉菌遗传操作手册［5］，采用Kriby-mix方法提取链霉菌基因组DNA。利用引物lmbB2-F:GCCGGAATTCGATGAGTTCACTCGAGGCACGC(下划线为 Eco RI酶切位点)，lmbB2-R:GCCCAAGCTTAGCACTGCCTGACCAGGCT(下划线为Hin dⅢ酶切位点)，扩增目的基因。TA克隆，转化DH5a感受态，测序。

从测序正确克隆菌中提取质粒，用 Eco RI和Hin dⅢ双酶切，回收片段连接到双酶切的载体pCDFDuet-1中，获得 pCDF-lmbB2表达载体，转化 BL21(DE3)感受态。

1.3 发酵培养

在M9培养基中，加入质量分数为0.4%的甘油，37 ℃，220 r/min，培养 BL21(DE3)/pCDF-lmbB2重组菌。菌体培养至OD600≈0.5，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，终浓度为1 mmol/L。每4 h测定 OD600，取样1 m L。样品10 000 r/min离心5 min，取上清用0.22μm滤膜过滤，用HPLC检测左旋多巴含量。

1.4 左旋多巴的测定

使用Agilent 6310型HPLC，二极管阵列检测器(DAD)，流动相为乙腈/0.08%甲酸为2.4/97.6，色谱柱 C18 柱(250 ×4.0，particle size，5 μm)，柱温30℃，检测波长280 nm，流动相流速1 mL/min，进样体积10μL。

1.5 酪氨酸的添加对发酵的影响

酪氨酸在水中的溶解度低，为了研究酪氨酸对发酵的影响，选定培养基中酪氨酸浓度分别为100、200、300、400 mg/L。 菌体培养至 OD600≈0.5，添加IPTG诱导，终浓度为1 mmol/L。

1.6 L-抗坏血酸对发酵的影响

M9培养基，添加0.4%甘油，酪氨酸300 mg/L。添加抗坏血酸的终浓度分别成为 100、1 000、3 000 mg/L。菌体培养至OD600≈0.5，添加 IPTG诱导，终浓度为1 mmol/L。

2 结果

2.1 lmbB2基因表达载体构建与表达

林可链霉菌lmbB2基因的编码区长度954 bp，编码产物LmbB2的理论大小为31 KD。由于该基因3’-端连续GC，不能有效扩增。为此在终止密码下游204 bp处设计了反向引物，PCR扩增整个片段大小为1 177 bp。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳如图2。连接到pEASY-T3载体上，经过酶切、测序鉴定，获得了lmbB2基因。进一步与pCDFDuet-1酶切连接，构建了pCDF-lmbB2表达载体(图3)，转化BL21(DE3)感受态，获得了工程菌株。

图2 lmbB2的PCR扩增产物Fig.2 Gel electrophoresis of PCR p roduct of lm bB2

图3 pCDF-lm bB2表达载体的酶切电泳图Fig.3 Gel electrophoresis of EcoRI/H ind II digestion of pCDF-lm bB2

IPGT诱导工程菌株后，LmbB2的蛋白质电泳如图4。LmbB2蛋白集中在上清部分，表明 lmbB2是可溶性表达。

图4 重组菌表达产物的SDS-PAGE电泳Fig.4 SDS-PAGE of E.coli L21(DE3)/pCDF-lm bB2

2.2 重组菌合成左旋多巴的能力

用M9培养基，IPTG诱导后连续发酵培养36 h，生长曲线如图5。重组菌和对照菌(无 lmbB2基因)的生长没有明显差异，表明外源基因 lmbB2对菌体生长无显著影响。左旋多巴生成曲线如图6。发酵4 h就检测到左旋多巴的合成，到16 h时左旋多巴的产量达到最大，为 37 mg/L，随后产量下降。

图5 重组菌的生长曲线Fig.5 G row th curve of the recom bination strains

图6 发酵过程中左旋多巴的含量Fig.6 Concentration of L-DOPA in ferm entation p rocess

2.3 底物酪氨酸对左旋多巴产量的影响

酪氨酸是LmbB2催化的底物，直接影响左旋多巴产量。添加酪氨酸后，重组菌的生长速度明显变慢(如图7)，左旋多巴的产量大大增加(图8)。当添加酪氨酸300 mg/L时，发酵32 h，发酵液中左旋多巴产量最高，为122 mg/L，与未添加组(15 mg/L)相比，提高了8倍，酪氨酸的转化率为40.67%。

图7 添加不同浓度L-酪氨酸对重组菌细胞生长的影响Fig.7 Effects of concentration of L-tyrosine on cell grow th

图8 添加不同浓度酪氨酸对左旋多巴的产量的影响Fig.8 Effects of concentration of L-tyrosine on yield of L-DOPA

2.4 L-抗坏血酸对左旋多巴合成的影响

在发酵过程中，发现左旋多巴的减少，伴随着培养液颜色变黑，可能左旋多巴被进一步氧化或聚合［6］。为此，添加还原剂抗坏血酸，左旋多巴的产量显著增强(图9)，而对大肠杆菌的生长影响不明显(图10)。添加3 g/L抗坏血酸，发酵32 h时，左旋多巴的产量最大，达285 mg/L，酪氨酸的转化率达95%。

3 讨论

图9 添加不同浓度抗坏血酸对左旋多巴产量的影响Fig.9 Effects of concentration of L-ascorbic acid on yield of L-DOPA

图10 添加不同浓度L-抗坏血酸时重组菌的生物量Fig.10 Effects of concentration of L-ascorbic acid on cell grow th

酪氨酸酶通常同时具有单酚氧化酶和二酚氧化酶活性，其中单酚氧化酶催化单酚羟基化，二酚氧化酶可将二酚类化合物氧化为醌类化合物。左旋多巴不稳定，在有氧条件下可自发氧化为多巴醌［7］。本实验结果表明，LmbB2可催化 L-酪氨酸转为左旋多巴，同时继续氧化多巴生成多巴醌，使培养液呈现黑色。为防止左旋多巴的氧化，可以加入还原剂。李华钟等［8］报道，以磷酸吡哆醛为辅酶，酪氨酸酚解酶催化邻苯二酚、丙酮酸和氨生成左旋多巴中，添加 Na2S2O3以及 EDTA，可以提高产率。本实验中添加Na2S2O3对LmbB2合成左旋多巴没有效果。Seetharam等［9］在生物合成左旋多巴中使用了NADH或者羟胺。

无论是在固定化酪氨酸酶中［10-11］，还是在用菌体催化L-酪氨酸转化为左旋多巴，使用抗坏血酸效果最好。Mariam等［12］在米曲霉转化左旋多巴的反应体系中添加抗坏血酸，可以使酶从预先生长的菌丝体中游离出来，在体外直接参与催化活动，减少底物吸收进入细胞的过程。Ho等［13］研究表明，添加抗坏血酸可以使反应体系中生成的多巴醌重新还原为左旋多巴。在本实验中，抗坏血酸的添加效果显著，左旋多巴大量积累。但当抗坏血酸消耗完全之后，这种效应消失，如图8所示，在发酵36 h后，左旋多巴积累减少，发酵液开始变为棕黑色。

在L-酪氨酸转化为左旋多巴的生物合成中，由于产物已被酶促和非酶促氧化，而不稳定。添加抗坏血酸具有很好的稳定作用，其效应与转化酶或微生物、培养基组成、发酵条件等有密切关系。本论文以300 mg/L L-酪氨酸，表达 LmbB2的工程大肠杆菌，添加3.0 g/L L-抗坏血酸，37℃下发酵培养36 h，获得左旋多巴的产量最高，是适宜的工艺条件。然而，添加抗坏血酸，增加了成本和工艺控制的复杂程度。在今后研究中，应该从代谢工程角度，平衡细胞内的氧化还原，开发左旋多巴的新转化工艺。

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