免疫佐剂应用的研究进展

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免疫佐剂应用的研究进展

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免疫佐剂；研究进展；应用

免疫佐剂是同抗原同时或预先注入机体，能增强机体对该抗原的免疫应答或改变其免疫应答类型的物质。自1926年Glenny首先应用铝盐粘附白喉类毒素至今，已广泛应用于人、兽疫苗，从而拉开了佐剂使用的序幕。随着分子生物学技术的发展，疫苗的类型已经从最初的灭活疫苗、减毒疫苗发展为亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗。但这些新型疫苗往往免疫效果不理想，免疫原性较弱，因此需要免疫佐剂的辅助以加强免疫效果。本文就常见免疫佐剂及其研究进展做一综述，现报道如下。

1 铝盐佐剂

铝盐佐剂具有安全、价廉、合成简单等优点，是最早允许可用于人用疫苗的佐剂。目前常见的铝盐佐剂包括氢氧化铝、氟化铝等。王大勇等[1]证实氢氧化铝吸附百日咳抗原对家兔和啮齿动物IgE抗体的产生有促进作用，氢氧化铝还能非特异性激活巨噬细胞，促进其产生白细胞介素-1（IL-1），并激活补体，选择性地诱导细胞因子[如白细胞介素-4（IL-4）]的产生。铝盐虽然具有良好的安全性，但亦有缺点：①只能增强体液免疫。②能诱导产生IgE抗体，导致注射部位出现红肿、红斑、硬结等不良反应。③铝在人体内长时间蓄积，还能导致脑病。④不耐低温，也不能冷冻保存。故铝盐佐剂已逐渐被一些新型佐剂所取代。

2 弗氏佐剂

弗氏佐剂是目前应用最广泛的实验用佐剂，分为弗氏完全佐剂（freund's complete adjuvant,FCA）和弗氏不完全佐剂（freund's incomplete adjuvant, FIA）。FIA是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温80）相混合而成，当与抗原混合时即形成油包水乳剂。在FIA中加入死的分枝杆菌，即形成FCA。通常FCA用于初次免疫，FIA用于加强免疫。弗氏佐剂具有较强的免疫增强效应，既可加强体液免疫又可加强细胞免疫。但动物多次注射弗氏佐剂后，会产生严重的不良反应，常引起肉芽肿、无菌性炎症、过敏反应等佐剂疾病。故弗氏佐剂常用于动物实验。

3 微生物佐剂

3.1 细菌毒素 细菌毒素是由菌体分泌的一种具有复杂性的天然蛋白质。目前已发现多种细菌外毒素具有免疫增强作用，其中常见的有霍乱肠毒素（cholera enterotoxin,CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin,LT）。二者结构有80%的相似性，均由一个A亚单位和五个B亚单位构成。A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有ADP-核糖基转移酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠皮细胞上的神经节苷脂GM1。动物实验表明，CT和LT能诱导APC表面表达B7-1、B7-2，为CD4+Th细胞活化提供协调刺激信号。CT通过IL-4诱导增强Th2细胞的免疫反应性，LT通过产生干扰素-γ（IFN-γ），增强Th1细胞的免疫反应性以及非IL-4依赖性Th2细胞的免疫反应性。CT、LT具有毒性作用，虽然动物实验表明，以CT作为疫苗佐剂通过鼻腔免疫小鼠，只是在嗅觉神经内沉积而未对大脑造成明显的病理损伤。但是为了确保其使用的安全性，还是试图通过多种方法降低CT、LT的毒性作用，如去除毒素中的毒性亚单位A、通过定点突变的方式降低LT和CT的毒性、Lycke等构建的基因融合蛋白CTA1-DD等。Mi-Young Kim等[2]构建了霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit,CTB）与登革热病毒的共识包膜蛋白结构域III（envelope protein domain III,cEDIII）融合基因在转基因水稻愈伤组织中表达的模型，通过在小鼠模型中的M细胞结合试验，显示出其结合肠上皮细胞、肠相关淋巴组织的M细胞的活性，表明CTB-cEDIII融合蛋白通过以抗原为目标的黏膜免疫系统来改善免疫应答是可行的。

3.2 脂质体 脂质体是单层磷脂或由数层可溶性物质隔开的呈同心圆状排列的连续多层磷脂所组成的微球体，具有佐剂兼载体功能，可包裹各种抗原和佐剂。革兰阴性菌细胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）属于类脂质。类脂质可储存抗原，缓慢释放可溶性抗原，并能将抗原呈递给巨噬细胞或树突状细胞诱导CTL应答。类脂质的免疫增强活性主要体现在对免疫系统中细胞成分的作用，如增强巨噬细胞活性，以及各种淋巴因子、细胞因子的释放[3]。单磷酸类脂A（monophosphoryl lipid A,MPL）是LPS的衍生物，保留了LPS的大部分免疫刺激活性而无毒性，成为较LPS安全的佐剂材料。MPL通过合成释放白细胞介素-2（IL-2）和IFN-γ诱发Thl类反应，MPL还可以促进抗原提呈细胞的移动和成熟。

3.3 CpG基序 CpG基序是一些以未甲基化的CpG为核心的寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotides,ODN），CpG基序主要存在于病毒、细菌及无脊椎动物的基因组中，脊椎动物基因组中较少[4]。CpG基序具有强烈的免疫激活功能，可通过其Toll样受体9（toll like receptor-9,TLR-9）激活天然免疫应答并诱导适应性免疫应答，能改善抗原提呈细胞的功能，诱导细胞因子/趋化因子，促进特异性抗原的免疫支持和特异性抗原的过继免疫应答，启动免疫刺激的级联反应，活化B细胞和树突状细胞；促进NK细胞、T细胞、单核/巨噬细胞的成熟、分化、增殖。Sungyoul Hong等[5]将CpG作为佐剂加入多发性骨髓瘤基因疫苗中对小鼠进行动物实验，其抗肿瘤免疫的效果优于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。应用CpG基序后，灵长类动物出现的最严重的不良反应是全身补体系统的激活，进而导致致死性血管通透性升高。庆幸的是，这种反应在CpG血清浓度低于40～50 μg/ml时不会发生。此外，CpG结合于血栓素可以导致活化部分凝血酶时间（activeated partial thr- omboplastin time,APTT）的延长。应用CpG是否会引起自身免疫病也是一个备受关注的问题，但是缺乏大规模临床对照试验。从目前积累的资料看，CpG致自身免疫病的可能低于IFN-α[6]。由于CpG在肠道内很快被降解，所以不能口服或在肠内使用。因此曹福娴等[3]把CpG3’末端和3’末端连接起来，以抵抗核酸酶的降解，这就是第二代免疫调节寡核苷酸（immunomodulatory oligonucleotides,IMO）。

3.4 热休克蛋白 热休克蛋白（heat shock protein, HSP）又称热应激蛋白或应激蛋白，是细胞或生物体在一些应激原。HSP是目前研究得较多的一种免疫佐剂，在疫苗中具有抗原载体和免疫佐剂的双重作用，广泛存在于原核、真核生物[7]。根据分子量的大小和同源程度，HSP分为五大家族：小分子量HSP（sHSP）、中等分子量的HSP 60家族、HSP 70家族、HSP 90家族、HSP 110家族[8]。HSP 70已成为目前研究较多的免疫佐剂。徐云升等[9]通过在体外构建HSP 70与人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）16型E711-20配体的复合物免疫小鼠，发现HSP 70能增强HPV 16型E 711-20配体的免疫效应，证实其有较好的免疫佐剂作用。Xiao-Ping Wang等[10]构建了由HSP 72与甲胎蛋白（AFP）构成的治疗性蛋白质复合物疫苗，发现AFP和HSP 72协同作用，能明显增加AFP特异性CD8+T细胞的反应并对表达AFP的肿瘤有明显的抵抗作用。HSP 70可以预防炎性损伤。

4 壳聚糖

壳聚糖是一种阳离子多聚糖，由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用而形成。壳聚糖具有黏膜吸附特性，可与黏液中带负电荷的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用，增加与黏膜接触的时间，以延缓抗原的清除，促进抗原穿过黏膜屏障并与黏膜下的淋巴组织发生作用。壳聚糖能够提高巨噬细胞、中性粒细胞的活性和积聚能力，抵抗病菌的侵入，诱导细胞因子的产生，增强迟发型变态反应（delayed hypersensitivity,DTH）和细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells,CTL）反应。口服不含蛋白抗原的壳聚糖，可引起白细胞介素-10（IL-10）释放及黏膜IL-4、TGF-β的表达，并激活脾脏的CD3+T细胞，明显上调黏膜Th2免疫反应。Zhiwei Sui等[11]将禽流感病毒基质蛋白2（matrix protein 2,M2）的有效成分sM2表达于大肠杆菌，以壳聚糖为佐剂鼻腔免疫小鼠，发现壳聚糖能有效提高sM2疫苗的疗效。

5 细胞因子

大部分佐剂多通过诱导细胞因子的产生来发挥其佐剂活性，如细菌毒素、壳聚糖等。因此可以直接添加细胞因子作为免疫佐剂。常见的可作为佐剂的细胞因子有IL-1、IL-2、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）、GM-CSF及趋化因子等。细胞因子佐剂中应用最为广泛的是IL-2。IL-2可作用于多种效应细胞，对免疫应答有广泛的上调作用。IL-12在体内主要参与机体的细胞免疫应答，是一种重要的诱导Th0细胞向Thl细胞分化的细胞因子，是一个应用较为广泛的细胞因子佐剂。IL-1能促进胸腺细胞和T细胞激活、增殖，表达IL-2受体，分泌细胞因子；能促进前B细胞增殖分化、表达膜表面免疫球蛋白（surface membrane immunoglobulin,SmIgM）和C3b受体。GM-CSF主要通过调节抗原递呈细胞的数量和功能来增强免疫应答强度，促进IL-2分泌及CD4+T细胞增生，从而使抗体及CD8+T细胞增加。趋化因子促进体液和细胞介导的免疫反应，包括调节细胞粘附、白细胞移动和归巢、血管生成，参与血细胞的生成和淋巴细胞的生成[12]。

6 免疫刺激复合物

ISCOM（immune stimulating complexes, ISCOM）是由皂角苷Quil A的糖苷、胆固醇、抗原及其他类脂质，在去垢剂作用下混合而成的直径为30～70 nm的立体笼状结构。其中Quil A本身就具有黏膜佐剂效应。ISCOM是一种有较高免疫活性的脂质小体，刺激B细胞反应，增加抗体产生；诱导T细胞反应，刺激产生CD4+、CD8+T淋巴细胞和细胞因子L-12。因此其可诱导细胞免疫应答同时增强体液免疫，特别适合小分子或半抗原而赋予高度免疫原性，从而持久而强烈的产生免疫应答。ISCOM还具有抵抗胃酸和胆汁的作用，经眼黏膜、鼻、口免疫，产生广泛刺激，诱导局部和全身免疫应答。其抗体滴度高于同等灭活抗原10倍以上，比自然感染抗体还高[13]。

7 结束语

佐剂自应用以来，在组成和类别上不断增加，对预防接种起到了至关重要的作用。佐剂的应用减少了疫苗的接种剂量，并且减少了过量疫苗接种而引起的不良反应。但是，由于有些佐剂本身具有一定毒性、致敏性、致炎性，大大制约了佐剂在人体的应用，因此，安全问题是目前佐剂使用的瓶颈。如何突破这个瓶颈，开发出安全、有效、便捷的佐剂，是未来佐剂研发工作的核心任务。相信随着免疫学技术的发展，新型的安全的佐剂将很快被发现和应用，不断地造福人类。

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R392.9

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1673-5846(2014)09-0213-03

1大庆医学高等专科学校病原生物与免疫学教研，黑龙江大庆 163000

2大庆医学高等专科学校过敏病医院，黑龙江大庆 163000