骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP 43基因表达的干预探索

徐汪洋

广东省第二人民医院，广东 广州 510317

实验研究

骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP 43基因表达的干预探索

徐汪洋

广东省第二人民医院，广东 广州 510317

目的了解骨髓基质干细胞（MSCs）移植对大鼠脊髓损伤（SCI）后脑源性神经营养因子（BDNF）与神经生长相关蛋白质（GAP 43）基因表达的干预。

骨髓基质干细胞；脊髓损伤；脑源性神经营养因子；神经生长相关蛋白质

一直以来，在神经科领域脊髓损伤后再生修复研究是其中的重要课题。根据相关的研究报道显示，在特定条件作用下，骨髓基质干细胞能够分化为星形胶质细胞或者神经细胞，在中枢神经系统植入MSCs，可以促使其得到进一步的分化，整合宿主神经元，产生髓鞘，其作用显著［1］。本文主要研究骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GAP-43与BDNF基因表达的干预，相关报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本组选择100只Wistar品系大鼠为实验对象，其中6只为6～8周龄SD品系大鼠，采用DMEM/F12（1：1）培养液（购自上海西唐生物科技有限公司），选用胰蛋白酶（购自上海第一生化药业有限公司）﹑胎牛血清（购自上海韵涵生物科技有限公司）﹑B27；SABC试剂盒与抗巢蛋白抗体 （购自上海亿欣生物科技有限公司）；PCR反应试剂盒与mRNA提取试剂盒（购自上海研卉生物科技有限公司）。

1.2 分离﹑培养与鉴定MSCs 在无菌基础上，将大鼠的股骨与胫骨进行分离，同时去掉两端的骨骺，使骨髓腔暴露，采用D-Hanks液清洗骨髓腔，并留置骨髓细胞的悬浮液体备用。接种工具为塑料培养瓶，温度调整为37℃，采用浓度为5%的二氧化碳来进行培养，于72 h后置换半量液体，继后每相隔72 h进行一次全量换液处理。于12 d左右，当细胞处于融合状态下，要清洗PBS，持续3次后置入浓度为0.0125%的胰酶，待消化时间达到2 min后采用浓度为10%的FBS停止培养液消化，收集悬液，采用1：3接种方式，移植细胞取为1×107/μI。选取CD44与CD34标记物来进行鉴定，排除造血干细胞。

1.3 制作SCI动物模型 麻醉雄性大鼠，运用AIIenA打击装置，损伤标准主要有三个方面：一是T10脊髓损伤，二是鼠尾出现痉挛性摆动，三是双下肢瘫。继后开始缝合，于皮下加入庆大霉素，术后予以挤尿处理。于大鼠MSCs后第7 d，其MSCs处处于空洞状况下分组观察，MSCs移植组取36只，DMEM填充组取36只，注入5 L培养液，对照组取28只，不作脊髓损伤处理。结合抗生素，于移植术后7 d内行腹腔注射。

1.4 BDNFmRNA与GAP-43mRNA表达分析 移植术后MSCs移植组与DMEM填充组分别于1 d﹑3 d后处死大鼠，取损伤节段脊髓；对照组于5 d后处死大鼠，取相应脊髓。提取总mRNA，采用逆转录法进行cDNA的合成，进而扩增PC，分析引物序列，观察预扩增产物的长度变化。基于电泳状态下，运用计算机图像分析仪对RT-PCR产物进行扫描，结合凝胶图像分析系统，对RT-PCR产物电泳条行光密度检查，继后定量BDNFmRNA与GAP-43 mRNA与表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0统计学软件对上述资料进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，P<0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

经由MSCs培养发现，原代细胞贴壁部分较少，于12 d左右在集落间发生融合作用，最终形成单层，细胞体细长，其形态与成纤维细胞相似。基于传代次数持续增加状况下，其细胞贴壁分布较为均匀，形态发展形似，主要为梭形，且胞体相对饱满，细胞增殖与传代较为稳定。对照组成年大鼠BDNFmRNA表达量低下，GAP-43 mRNA呈弱表达。移植术后24 h，MSCs移植组与DMEM填充组均发现BDNFmRNA与GAP-43 mRNA表达，MSCs移植组表达量高于DMEM填充组（P<0.05），BDNFmRNA表达增加了22%左右，GAP-43 mRNA表达增加了20%左右。于移植术后72 h，两组的BDNFmRNA与GAP-43 mRNA表达量均处于上升趋势，且前者BDNFmRNA表达量较后者平均提升了26%左右（P<0.05），GAP-43 mRNA表达平均提升了26%左右（P<0.05）。在移植术后第7 d，DMEM填充组两种表达量均出现下降，而MSCs移植组处于增长态势。

3 结论

脊髓损伤根治关键在于神经元再生能力的恢复，临床上主要在脊髓损伤处植入组织进行治疗。MSCs作为一种非造血组织干细胞，自我更新能力﹑增殖能力与贴壁能力强，可以收集MSCs悬液，同时多向分化功能优越，一定条件下可以分化成软骨细胞﹑成骨细胞﹑肌细胞﹑脂肪细胞与神经细胞，可移植性优越［2，3］。在动物损伤脊髓内植入MSCs，经由组织学发现其与星形胶质细胞有关，可构建桥联结，可见神经纤维，基于体外诱导分化剂推动下，可进行神经元特异性标志物的表达，治疗脊髓损伤具有可行性，但治疗机制尚不明确［4］。

脑源性神经生长因子作为一种小分子蛋白质，与神经生长因子具有同源性，对神经元生存﹑分化与神经元维持等方面起着至关重要的作业，抗损伤性刺激作用显著，能够推动神经元的再生，保护神经元功能，预防神经元细胞病变。根据相关研究显示，采用BDNF基因与NGF基因对BMSCs进行修饰，经由静脉移植促使其进入SCI区，可分泌神经营养因子，预防脊髓继发损伤［5］。GAP 43是一种胞膜磷酸蛋白质，主要分布于神经元与神经胶质细胞等处，神经元促生功能显著，已经成为了神经发育﹑突触重建与轴突再生的可塑性特异性标志。临床上神经再生主要显示为GAP-43基因高表达，与脊髓再生具有密切的关联性。通常SCI后其GAP-43表达将会增加，表明其再生作用显著。基于外源性营养因子缺乏状况下，GAP-43可以使神经长出新突起，提升神经可塑性，实现突触重构与递质释放。在本文研究显示，经由MSCs移植后GAP-43基因与BDNF早期表达显著增强，表明脊髓损伤修复速度快，这与相关研究报道具有一致性。

综上所述，MSCs移植可显著增加BDNFmRNA与GAP-43 mRNA表达水平，其脊髓损伤修复作用值得临床应用。

［1］智春升，谢林.骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP-43基因表达的影响.中国矫形外科杂志，2009（18）：1404-1406.

［2］邓莉，杨朝鲜，涂江义，等.移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用.中国组织工程研究与临床康复，2010（14）： 2583-2587.

［3］陈良，刘阳.骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤区NGF与BDNF表达的影响.四川医学，2011（03）：320-323.

［4］贾宏伟，李艳英.骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦修复大鼠脊髓损伤. 中国组织工程研究与临床康复，2011（10）：1783-1788.

［5］刘志刚，郑启新,熊敏.骨髓间充质干细胞移植联合孕酮应用对脊髓损伤的修复作用.华中科技大学学报(医学版)，2012（03）：296-302.

R295.6

A

1674-9316（2014）04-0093-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.04.058

方法大鼠脊髓损伤后第7 d经肋间后动脉介入植入MSCs，基于无菌条件下，实验分成三组，即MSCs移植组（36例）、DMEM填充组（36例）以及正常对照组（28例），采用RT-PCR法分析MSCs移植后GAP-43与BDNF基因表达变化状况。

结果针对BDNFmRNA与GAP-43 mRNA表达水平而言，MSCs移植组上升程度明显高于单纯损伤组。

结论基于MSCs移植作用下，脊髓损伤区的环境得到了明显的改善,增加BDNFmRNA与GAP-43 mRNA的表达水平,其脊髓损伤修复作用显著。