明日叶根黄酮与DNA相互作用的光谱研究

刘红，姜伟，刘炜，杨焕兴，韦吉崇，启冠军，雷爱娜，钟晴，刘楠楠，邓苏梦，王凯悦

（海南师范大学海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南海口571127）

明日叶Angelica keiskei 别名明日草[1]、八丈草，含有人体所必需的各种维生素、矿物质，其根茎中含有丰富的天然黄酮（flavonoid）和香豆素（Coumarin），这些物质具有抗菌、抗癌作用。通常认为，脱氧核糖核酸（DNA）是重要的遗传物质，与药物分子的相互作用会影响到DNA 转录和翻译[2]，从而引起活细胞的物理化学性质和生理功能的改变，起到抗癌[3]或者药效作用，因此众多学者开始致力于研究药物分子与DNA 的相互作用。目前，通常对药物分子通过沟槽或是嵌插结合在核酸的螺旋沟或碱基中，诱发许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达，特别是嵌插作用，或直接抑制DNA 的复制和转录功能；或在经过进一步活化后，使DNA 断裂受损而影响其功能。研究药物小分子与DNA 的相互作用机制，有利于了解药物的作用机理，进而为新药设计和筛选提供有价值的信息[4]。有关明目叶根的黄酮类化合物与DNA 相互作用的光谱分析尚未见报道，本文通过对明日叶根某些黄酮类化合物与DNA 相互作用机制的研究，旨在为明日叶药理活性的研究和利用提供有价值的信息，同时对高效、低毒天然药物的设计与开发具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪：大连依利特分析仪器有限公司；RF-5301 荧光分光光度仪：日本岛津公司；明日叶根：青岛开源集团环保工程有限公司；鲱鱼：DNA Sigma 公司；薄层色谱板Kieselgel 60 F254：Merck 公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 明日叶根黄酮的分离与纯化

取明日叶根洗净、粉碎，过100 目筛，分别称取100 g 粉末按料液比1∶10 的比例加入75%的乙醇，浸泡24 h 后过滤，滤渣用75%的乙醇重新处理三次，合并滤液，得到明日叶根黄酮初提液。用石油醚浸泡12 h，以除去脂溶性物质，过滤，得到下层黄色液体，减压浓缩，得到黄色膏状提取物，低温保存。

将明日叶根黄酮膏状提取物用层析硅胶（100 目）拌样，经正相硅胶柱层析分离，以90%甲醇进行梯度洗脱，每10 min 接一次样，后通过薄层层析色谱追踪，合并斑点相同的组分，得到（A-G）7 个馏分。

将G 馏分浓缩用层析硅胶（100 目）拌样，经硅胶柱层析用正己烷-乙酸乙酯2∶1 梯度洗脱，每5 min 接一次样，经薄层层析色谱追踪后合并斑点相同组分得到（G1-7）7 个馏分，取G7 馏分，得到黄酮提取物。

1.3 明日叶根黄酮提取物与DNA 相互作用的光谱研究

1.3.1 DNA 猝灭实验

在4 个10 mL 容量瓶中，依次分别加入固定量明日叶根黄酮溶液和不同量的DNA 溶液，随后均加入固定量的pH=7.2 的Tris-HCl 缓冲溶液并用二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，在荧光仪上进行荧光光谱和吸收光谱的测定。荧光激发波长为368 nm，发射波长为450 nm，狭缝宽均为5 nm。

1.3.2 UV-vis 光谱

在4 个10 mL 的容量瓶中，分别加入固定量的Tris-HCl 缓冲溶液和固定量的DNA 溶液，随后分别加入不同量的明日叶根黄酮溶液并用二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置10 min 后进行紫外光谱测定。

2 结果

2.1 明日叶根黄酮提取物对DNA 紫外吸收光谱的影响

一般而言，化合物与DNA 如果存在相互作用就必然会在吸收光谱中有所反映，因为具有双螺旋结构的DNA 分子中由于含有芳香性碱基与磷酸生色团而在260 nm 左右存在一强烈的吸收。DNA 的碱基是许多药物与DNA 作用的位点，药物与DNA 结合将引起DNA 特征吸收峰的变化，见图1。

从图1可以发现，随着溶液中明日叶根黄酮浓度的逐渐增大，DNA 的紫外吸收光谱出现了增色效应和红移现象，这种增色效应是由于嵌插剂嵌入核酸双螺旋结构中，并且嵌入剂可在两个碱基对之间滑动，从而降低了与核酸的超螺旋程度密切相关的链环数，使得超螺旋的紧密结构变成较为松驰的状态[5]。Long 理论认为红移现象是小分子与DNA 发生嵌插作用的标志，由此可以初步推断明日叶根黄酮分子可能嵌插进DNA 的碱基对中，结合到DNA 的亲核位点，引起了紫外吸收官能团的改变[6-7]。

图1 不同明日叶根黄酮浓度下的紫外吸收光谱Fig.1 The ultraviolet absorption spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone

2.2 DNA 存在下明日叶根黄酮提取物的荧光光谱

图2为DNA 存在下明日叶根黄酮的荧光发射光谱。

图2 DNA 存在下明日叶根黄酮提取物的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone

从图2中可以看出，明日叶根黄酮在450 nm（λex=368 nm）处有一最大发射峰。DNA 的存在可使明日叶根黄酮最大荧光发射峰的荧光强度发生猝灭。当DNA 浓度逐渐增大时，猝灭程度逐渐增强。表明DNA和明日叶根黄酮可能形成了复合物。

2.3 猝灭机制

由荧光猝灭的Stem-Volmer 方程：

式中：F0为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度；F 为猝灭剂浓度等于C 时荧光物质的荧光强度；KSV 为Stem-Volmer 猝灭常数[8-10]，（L/mol）。

求出在298 K 时，DNA 对明日叶根黄酮的Stem-Volmer 猝灭常数KSV 为0.94×103L/mol，同时温度升高，其KSV 为0.93×103L/mol。如果对动态猝灭来说，其猝灭常数随温度升高将会升高，因此上述结果表明DNA 对明日叶根黄酮的荧光猝灭不是由于分子间动态碰撞，而是静态猝灭。

2.4 DNA 与明日叶根黄酮提取物二元络合物的组成及其结合常数

静态荧光强度与猝灭剂的关系[7]，如公式（2）所示。

式中：F0与F 分别代表未加入和加入DNA 时的荧光强度；K 为明日叶根黄酮与猝灭剂之间的结合常数，（L/mol）；C 为猝灭剂DNA 的浓度；n 为结合位点数。

由式（2）分别作出明日叶根黄酮-DNA 体系的关系图（图3）。

图3 25 ℃下明日叶根黄酮-DNA 体系的F0/F-C 工作曲线Fig.3 F0/F-C working curve in the different concentrations of Angelica keiskei Roots flavone and DNA system at 25 ℃

通过斜率和外推截距可以求出明日叶根黄酮与猝灭剂之间的结合常数。25 ℃时明日叶根黄酮与DNA之间的结合常数为5.35×105L/mol，经典插入方式是与结合DNA 的溴化乙锭的结合常数为4.9×105，这说明明日叶根黄酮提取物与DNA 主要以插入方式。

图4 303 K 和298 K 下明日叶根黄酮-DNA 体系的lg[（F0-F）/F]-lg[C]工作曲线Fig.4 lg（F0-F）/F-lg[C]working curve in the system of Angelica keiskei roots flavone and DNA at 303 K and 298 K

2.6 分子之间作用力的测定

小分子和大分子之间作用力包括氢键，范德华力，静电引力和疏水作用，热力学参数焓变△rHsm，熵变△rSsm和自由能△rGsm决定热力学模式，热力学有关参数计算公式[11]如下：

表1 结合反应的热力学参数Table1 Thermodynamics parameters in binding reaction

3 结论

用荧光法[11]和紫外吸收光谱法研究了DNA 与明日叶根黄酮的相互作用，明日叶根黄酮在450 nm（λex=368 nm）处有一最大发射峰。DNA 的存在可使明日叶根黄酮最大荧光发射峰的荧光强度发生猝灭。当DNA浓度逐渐增大时，猝灭程度逐渐增强。

DNA 与明日叶根黄酮之间存在较强的相互作用，25 ℃时结合常数为5.35×105L/mol 结合方式是明日叶根黄酮通过插入方式与DNA 结合，他们之间主要靠分子之间的氢键和范德华力。

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