灵芝多糖深层发酵生产研究进展

侯晓梅，张敏，杨海龙，*

（1.温州市质量技术监督检测院，浙江温州325000；2.温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州325027）

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国名贵的药用真菌，其子实体素有“仙草”之称，具有很高的保健和药用价值，卫生部已批准灵芝为食品新资源。灵芝在中国、日本、韩国等国家的应用已有2000 多年的历史，目前在加拿大、美国等西方国家也广受欢迎，据估计，全球灵芝产品的市场超过15 亿美金[1]。灵芝含有多种化学成分，如多糖、灵芝酸、甾醇、核苷、生物碱、蛋白质、脂肪酸等，其中多糖被认为是灵芝的主要活性成分之一，灵芝多糖的研究一直受到国内外学者的广泛关注，目前从灵芝中分离获得的灵芝多糖超过200种[2]。灵芝多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗辐射、抗疲劳等多种生物活性[3-9]。

目前，灵芝的生产主要有固体培养法和深层发酵法。固体培养方法经济有效，可以长出子实体，且取材方便，是一种有效的获取灵芝产品的方法；但固体培养法的缺点是培养周期较长，且较难有效地确定培养终点和严格控制产物的含量和质量。深层发酵方法不受季节的影响，且液体菌种的培养周期短，成本低，能快速增殖菌体细胞，活性物质的有效成分易于控制，能显著提高生产效率等优点，受到人们的广泛关注[5，10-13]。研究表明，液体深层发酵生产的灵芝多糖与来源于灵芝子实体、孢子的灵芝多糖具有相似的功效[13-14]，液体深层发酵技术是获取灵芝多糖类化合物的重要手段[5，7，12-15]。

1 培养基

1.1 碳源

灵芝深层发酵中可利用的碳源包括葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、酒糟等。但不同的菌株对各种碳源的利用率不同，而且同一菌株生产不同的代谢产物时亦可能需要不同的最佳碳源，如有研究表明乳糖作为碳源利于产胞外多糖，而葡萄糖有利于产胞内多糖[16]。

葡萄糖等单糖是灵芝菌的优质碳源，但葡萄糖质量浓度太高和太低都不利于胞外多糖产率的提高，太低时营养基质用于长菌体的比例增加但葡萄糖质量浓度大于60 g/L 时，延滞期要滞后24 h 左右，产量反而下降，说明较高质量浓度碳源对菌体生长具有抑制作用[17]；葡萄糖的浓度一般应控制在5%以内，罗建成等的研究表明在一定范围内，菌丝体产量和胞外多糖浓度随葡萄糖含量增大而增大，当葡萄糖含量为5%时产量最高，随着葡萄糖含量继续增加，由于高浓度的葡萄糖对菌丝体的生长产生了抑制效应，产量反而下降[18]；Fang 等的研究亦得到同样的结论，50 g/L 的起始葡萄糖浓度最有利于胞内、胞外多糖的生产[15]。

蔗糖、乳糖等也是灵芝菌的理想碳源[19-20]；Tang 等的研究表明乳糖是最适于灵芝菌体的生长和胞内多糖的合成，而蔗糖是灵芝胞外多糖合成的最佳碳源[20]。

复合碳源具有原料来源丰富、成本低廉的优点，研究表明玉米粉有利于菌丝体的生长和胞外糖肽的生产[21]。灵芝菌可分泌淀粉酶，能利用淀粉为原料进行生长代谢，而且在灵芝液体发酵时，灵芝菌丝体往往形成菌球，玉米淀粉等的存在还能为菌丝体提供附着物，从而有利于菌体的生长。在发酵时大多使用葡萄糖与淀粉类物质共同作为碳源，葡萄糖与玉米粉配合作为碳源，多糖产量较高，原因可能是玉米粉中含有维生素、纤维素、核苷酸等多种营养成分，有利于菌丝体的生长和多糖的积累与分泌[22]。

1.2 氮源

相对于无机氮源，灵芝对有机氮源利用更迅速，采用有机氮源有利于提高细胞生长速率和最终生物量，并可促进代谢产物的生产。一般灵芝适用的有机氮源有酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼粉、麸皮等。研究表明蛋白胨有利于多糖的生产[16]；豆粕粉最适合灵芝菌丝生长，尿素最适合灵芝胞外糖肽生产[21]；对于灵芝深层发酵，有时采用配合氮源更有利于菌体的生长代谢，方庆华等的研究表明同时添加5 g/L 蛋白胨和10 g/L酵母膏条件下细胞生长达到最大（15.8 g/L），胞内多糖产量也达到最大（0.858 g/L），但胞外多糖产量在同时添加5 g/L 蛋白胨和5 g/L 酵母膏条件下达到最大，达0.805 g/L[23]。常景玲等研究后认为以蛋白胨与麸皮配合氮源，灵芝多糖产量最高[22]。胡焕荣认为氮源是灵芝菌丝体主要物质，氮源过少会导致菌丝体生命力较弱，出现菌丝体提前自溶，在灵芝发酵培养基中除玉米粉、豆粕粉中带入的氮源外，再采用酵母膏补充氮源，有利于灵芝菌丝体的生长及多糖的生产[24]。

由于研究菌株的不同，也有研究认为无机氮源亦可促进灵芝代谢产物的生产，梁海秋研究了灵芝2165的发酵培养基组成，硝酸铵为氮源时胞外多糖的产量最高，达3.422 g/L，胰蛋白胨和硫酸铵次之，大豆粉也不错，尿素和大豆蛋白胨较差[25]。

使用复合碳、氮源由于有原料来源丰富、成本低廉的优点，是工业化生产的首选，刘高强等采用中心组合旋转设计法和响应曲面法获得多糖发酵的最优配方为：玉米粉19.6 g/L，麸皮粉11.0 g/L，豆饼粉6.7 g/L，蔗糖19.1 g/L，150 L 发酵罐中试放大结果表明，多糖产量为1.86 g/L[26]。

1.3 无机盐

灵芝菌丝体生长需要矿质元素，如铁、镁、磷、钾、钠、铜、锰、钼、铬等。研究表明K+、Mg2+和Fe2+可以促进灵芝多糖液态发酵，在种子液培养基基础上加入0.2%Fe2+更有利于灵芝多糖产量的提高[27]。

Hsieh 等的研究结果显示缺乏磷酸盐可显著降低菌丝体中多糖含量，而限制镁离子供应则能得到大分子量的低产量多糖[28]。陈志杰等采用Plackett-Burman试验设计，选取葡萄糖、蔗糖、玉米浆干粉、蛋白胨、黄豆芽汁、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、ZnSO4·7H2O、VB1、谷氨酸钠等对灵芝生长及产胞外多糖相关因子进行试验，结果表明蔗糖、KH2PO4和MgSO4对灵芝菌丝生长及灵芝产胞外多糖具有显著影响[29]。

一般在灵芝菌深层发酵培养时，往往使用自来水及玉米淀粉、酵母膏等复杂营养成分，在这些营养成分中含有灵芝生长代谢所需的大部分无机盐，一般情况下，只要在培养基中加入磷酸二氢钾（0.1%～0.2%），硫酸镁（0.05%～0.15%）就能达到灵芝菌丝体的生长要求[24]。

1.4 生长因子及促进剂

玉米粉、酒糟、糖密等复杂营养基质有利于灵芝菌的生长及其代谢产物的生产，其中原因之一就是这些营养基质中含有维生素等生长因子。目前研究的灵芝发酵生长因子及促进剂主要包括维生素、植物油、醇类物质等。研究表明在一定浓度范围内，VB1能促进菌丝体生长和提高多糖产量，肖雷等认为以添加10 mg/L浓度的效果最佳[17]；而胡焕荣认为在培养基中加入VB150 mg/L 能促使菌丝体生长粗状[24]。张华山等的研究认为在培养基中添加VB5作为生长因子能更好地促进多糖的合成，效果优于VB1[16]。

在一定含量范围内，三十烷醇能促进菌丝体生长并提高多糖产量，其中以添加1 mg/L 三十烷醇的效果最佳，这可能是由于三十烷醇在一定含量范围内能改善细胞的通透性所致[18]。其它小分子醇类也有类似的作用，Yang 等的研究表明在培养基中添加1.5%的乙醇或丙醇亦可促进灵芝菌丝体的生长及其胞外多糖的生产[30]。

在灵芝菌的工业发酵过程中，由于菌体、蛋白等成分的存在会产生泡沫，往往需在培养基中添加一定量的植物油，研究表明在培养基中加入1%的豆油、花生油、红花子油、玉米油、葵花子油、橄榄油可不同程度地促进灵芝菌的生长，除豆油外，其它植物油均可促进胞外多糖的合成[10]；Chang 等的研究亦表明红花子油（3.44 g/L）能显著促进菌体生长，橄榄油（3.96 g/L）可提高多糖的合成[19]。Yang 等还研究了脂肪酸对灵芝菌发酵的影响，表明在0.3 g/100 mL 添加量内，棕榈酸、油酸可促进菌体的生长及胞外多糖的合成，硬脂酸在低添加量（0.1 g/100 mL）亦可促进菌体的生长及胞外多糖的合成，而亚油酸对灵芝菌的生长代谢有抑制作用[10]。

一些中药成分对灵芝菌的深层发酵具有显著影响，并能促进灵芝菌活性产物的生物合成。党参、枸杞、山药、薏苡仁、芦荟等中药的水提物（187.5 g 生药/L 水提液）可促进灵芝菌的生长；薏苡仁、党参、山药、牛膝的醇提物可促进灵芝菌的生长及胞外多糖的生产[31]；Liu 等的研究表明药用昆虫蜣螂在添加量为5 g/L 时能显著促进灵芝胞内多糖和胞外多糖的形成（P＜0.05），胞内多糖和胞外多糖的产量分别由对照的（1.93±0.09）g/L 和（520.3±20.2）mg/L 提高到（2.41±0.12）g/L 和（608.9±20.2）mg/L，但添加蜣螂发酵后，灵芝胞内多糖和胞外多糖主要组分的合成途径并未改变[32]。

2 培养条件

2.1 接种量与菌龄

菌龄太小，接种后的延滞时间变长，发速时间拉长，菌龄太老，菌丝容易老化自溶，都不利于灵芝菌的生长及代谢产物的生产，一般灵芝菌的菌龄以4 d～5 d比较适合[18]。

接种量的大小决定了菌体的生长速度。灵芝深层发酵一般的接种量以5%为宜[17-18]；李平凡等的结果显示8%～10%最佳[33]；胡焕荣认为在发酵罐发酵时接种量在10%可大大提高了设备的利用率，降低了发酵周期，减少了杂菌污染机会[24]；不同的发酵产物生产时可能需要不同的接种量，方庆华等的研究认为表明低的接种量有着较高的平均生长速度，但是其多糖产量较低；在接种量为170 mg/L 条件下胞内和胞外多糖的产量分别为0.699 g/L 和0.670 g/L，而高的接种量有利于多糖的秤，在接种量为670 mg/L 条件下胞内和胞外多糖的产量却分别达到1.220 g/L 和0.874 g/L[23]。

2.2 pH

灵芝菌可在较宽的pH 范围（3～7.5）生长[11]，但以微酸性（pH 为5.5～6.5）为最佳，当pH 低于3.5，菌丝体生长缓慢，甚至停止生长并产生自溶现象[24]。但不同菌株的最适pH 差异非常大，如紫芝胞外多糖发酵在初始条件设为pH 5.4 时产生最多，而赤芝、甜芝胞外多糖的发酵产量不受初始pH 试验范围的影响；赤芝、紫芝在初始pH 4.8 条件下发酵胞内多糖积累最少，而甜芝此条件下发酵胞内多糖积累最多[34]。

菌丝体的生长和胞外多糖生产的最适pH 并不一致。Babitskaya 等的研究表明pH 6～7 最适宜菌体生长，pH 6～4 有利于胞内及胞外多糖的合成[11]，Chang 等获得了类似的研究结果，菌体生长最适pH6.5，多糖为5.5～6.5[19]；李平作等研究了灵芝发酵过程中pH 的变化规律，发现起始pH 为5.5 有利于菌体生长及多糖的合成，pH 控制在5.5 时生物量最大，但多糖产量最低；若在发酵过程中控制pH 在4.0 时，胞外多糖产量最高，较未控制提高24%[35]；然而，Yang 等认为pH 4～4.5 最有利胞外多糖的合成，控制pH 恒定在4 不利于多糖的合成[36]；Fang 等的研究表明pH 6.5 时最有利于灵芝菌体生长，将pH 从6.5 降至3.5 有利于胞内及胞外多糖的生产[37]。毛健等采用分阶段的pH 控制策略，初始pH 6.0，菌体生长前期（0 h～40 h）控制pH 为5.5，40 h～48 h 控制pH 5.0，48 h 后至发酵结束控制pH4.5，灵芝胞外多糖最高达到3.23 g/L[38]。

2.3 温度

灵芝发酵的生长温度范围较广，灵芝菌在22 ℃～35 ℃内都可以生长。但生长的最佳温度范围要窄一些，而且不同的菌株亦不一样，胡焕荣认为温度是菌丝体中酶反应的必须条件，在高温条件下酶反应快，菌丝体生长也快，但菌丝体容易衰老，不易积蓄多糖。在低温条件下，各种酶反应不协调，菌丝体也就停止生长，灵芝菌最佳生长温度为（27±1）℃[24]；肖雷等的研究表明灵芝菌在25 ℃～30 ℃生长势良好，28 ℃是生长的最适温度[11，17-18]。稍高的温度有利于灵芝代谢产物的生产，Yang FC 等认为30 ℃～35 ℃适宜灵芝菌生长及胞外多糖的合成[36]；Chang MY 等认为最适菌体生长与多糖合成的温度为34 ℃[19]。

2.4 通风与搅拌

灵芝多糖的发酵在实验室常在摇瓶中完成，而工业生产则在不同规格的发酵罐中完成。菌丝体深层发酵过程中氧气过多过少都会影响菌丝体生长，而培养基中溶解氧与通风量、罐压、搅拌的转速有关，通风量过大，易导致菌丝体衰老，并增加杂菌带入的机会；罐压过高，二氧化碳的含量增加，抑制灵芝菌丝体生长；搅拌的转速过快，导致菌丝体纤维组织损坏，培养基的稠密度增加，影响氧气在培养基中的溶解度。胡焕荣确认发酵罐操作条件为通风量在1：0.3 m3/m3·h～0.5 m3/m3·h，罐压0.5 kg/cm2，转速90 r/min 左右，灵芝菌丝体生长条件最佳[24]。孙金旭等在7 L 发酵罐中得出灵芝真菌培养的最佳工艺为转速200 r/min、通气量200 L/h，在此条件下菌丝体最大产量达7.35 g/L，胞外多糖干重最高产量达0.92 g/L[39]。

灵芝菌是好氧真菌，对培养基中的溶氧进行调节，控制溶在较高水平有利于菌体生长及多糖的合成，发酵控制在最适溶氧80%水平时，生物量、胞内多糖、胞外多糖可比不控制条件下分别提高46%、44%和21%[38]。

3 展望

现阶段国内外对灵芝液体深层发酵技术的已取得较大进展，在发酵培养基、发酵条件和发酵过程的优化等方面作了大量研究，研发了二阶段pH 控制[39]、补料-分批发酵[12]、补料与三阶段光照相结合[40]等发酵工艺，筛选了植物油、脂肪酸、醇类、表面活性剂、中药提取物等外源促进剂以提高灵芝多糖的生物合成[10，19，30-32]。但目前对灵芝发酵促进剂的研究还只停留在种类筛选、添加浓度及对活性成分生物合成促进效果的分析，而对其促进机理的研究尚在起步阶段。另外，有关高等真菌多糖生物合成代谢途径及其调控方面的研究基本是一片空白，灵芝多糖的研究也主要集中在灵芝多糖的分离、结构鉴定、药理作用，以及培养技术方面，国内外尚未见灵芝菌多糖合成代谢途径及其调控方面的研究。灵芝子实体和菌丝体产生的多糖在结构、活性上不尽相同，发酵促进剂提高灵芝多糖发酵生产机理以及灵芝多糖合成过程的解析应是灵芝多糖发酵研究的重要内容，加强这些方面的研究，实现灵芝多糖生物合成的定向调控，可促进高活性灵芝多糖组份的发酵生产。

[1] Heleno S, Barros L, Martins A, et al.Fruiting body, spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal：A comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts[J].Food Research International,2012,46:135-140

[2] 杨海龙, 活泼, 肖彩霞, 等.药用真菌深层发酵生产技术[M].北京：化学工业出版社,2009

[3] Cui XY,Cui SY,Zhang J,et al.Extract of Ganoderma lucidum prolongs sleep time in rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,139:796-800.

[4] Jin H, Jin F, Jin JX, et al.Protective effects of Ganoderma lucidum spore on cadmium hepatotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology,2013,52:171-175

[5] Zhou XW, Su KQ, Zhang YM.Applied modern biotechnology for cultivation of Ganoderma and development of their products[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93:941-963

[6] Pan K, Jiang Q, Liu Q, et al.Optimization extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides and its immunity and antioxidant activities[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 55:301-306

[7] 刘高强,赵艳,王晓玲,等.灵芝多糖的生物合成和发酵调控[J].菌物学报,2011,30(2):198-205

[8] 王君巧,聂少平,余强,等.黑灵芝多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节和抗氧化作用[J].食品科学,2012,33(23):274-277

[9] 叶志能,李德远,王斌,等.灵芝多糖研究进展[J].食品研究与开发,2012,33(1):225-228

[10] Yang FC, Ke YF, Kuo SS.Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures[J].Enzyme and Microbial Technology,2000,27：295-301

[11] Babitskaya VG, Shcherba VV, Pushkova TA, et al.Polysaccharides of Ganoderma lucidum：Factors affecting their production[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2005,41：169-173

[12] Tang YJ, Zhang W, Liu RS, et al.Scale-up study on the fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for the hyperproduction of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides[J].Process Biochemistry,2011,46：404-408

[14] Li Y,Fang L,Zhang K.Structure and bioactivities of a galactose rich extracellular polysaccharide from submergedly cultured Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers,2007,68,323-328

[15] Fang QH,Zhong JJ.Submerged fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum for production of valuable bioactive metabolites—ganoderic acid and polysaccharide[J].Biochemical Engineering Journal,2002,10:61-65

[16] 张华山,李亚芳,余响华.灵芝多糖发酵工艺条件的研究[J].氨基酸和生物资源,2005,27(4):30-31

[17] 肖雷,姚菁华,吕兆启.优化发酵条件提高灵芝多糖产率的研究[J].食品科技,2007(8):126-129

[18] 罗建成,史政海.灵芝深层发酵工艺研究[J].化学与生物工程2007,24(1):41-45

[19] Chang MY,Tsai GJ,Houng JY.Optimization of the medium composition for the submerged culture of Ganoderma lucidum by Taguchi array design and steepest ascent method[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,38：407-414

[20] Tang YJ, Zhong JJ.Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J].Enzyme and Microbial Technology,2002,31：20-28

[21] 袁保京,张日俊.碳氮源对灵芝液体发酵胞外糖肽产量的影响[J].中国农业大学学报,2012,17(1):119-124

[22] 常景玲,李慧,朱佩燕.灵芝多糖发酵工艺优化[J].中国食用菌,2005,24(6):47-48

[23] 方庆华,钟建江.灵芝真菌发酵生产灵芝多糖和灵芝酸[J].华东理工大学学报,2001,27(3):254-258

[24] 胡焕荣.灵芝菌丝体深层发酵工业化生产的研究[J].食品科学,2006,27(2):196-198

[25] 梁海秋,田春龙,杨辉,等.液体发酵灵芝菌胞外多糖的研究[J].现代食品科技,2007,22(2):55-57

[26] 刘高强,王晓玲,韩文军,等.响应曲面法优化灵芝廉价型深层发酵培养基的研究[J].菌物学报,2009,28(6):825-831

[27] 叶盛权,吴晖,余以刚,等.不同金属离子对灵芝多糖液态发酵的影响[J].食品研究与开发,2011,32(1):106-108

[28] Hsieh C,Hsu TH,Yang FC.Production of polysaccharides of Ganoderma lucidum (CCRC36021）by reusing thin stillage[J].Process Biochemistry,2005,40：909-916

[29] 陈志杰,韩永斌,沈昌,等.Plackett-Burman 设计在灵芝生长及产胞外多糖主要影响因子筛选中的应用[J].食品科学,2005,26(12):115-118

[30] Yang HL, Wu TX, Zhang KC.Enhancement of mycelial growth and polysaccharide production in Ganoderma lucidum (the Chinese medicinal fungus,‘Lingzhi’）by the addition of ethanol[J].Biotechnology Letters,2004,26：841-844

[31] 杨海龙,唐华.中药对药用真菌深层发酵的影响[J].食品与发酵工业,2009,35(4):128-131

[32] Liu G Q,Zhang K C.Enhancement of polysaccharides production in Ganoderma lucidum by the addition of ethyl acetate extracts from Eupolyphaga sinensis and Catharsius molossus[J].Applied Microbiology ＆ Biotechnology,2007,74：572-577

[33] 李平凡,姚松君,邱玉美.灵芝液体发酵工艺优化研究[J].食品科技,2012,37(1):33-35

[34] 曾东方,张小朋,罗雪莲,等.初始pH 值对不同灵芝深层发酵菌体多糖的影响[J].化学与生物工程,2004,(5):19-21

[35] 李平作,章克昌.灵芝胞外生物活性多糖的pH 控制发酵[J].微生物学通报,2000,27(1):5-8

[36] Yang FC, Liau CB.The influence of environmental conditions on polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in submerged cultures[J].Process Biochemistry,1998,33(5):547-553

[37] Fang QH, Zhong JJ.Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum[J].Process Biochemistry,2002,37：769-774

[38] 毛健,马海乐.灵芝菌体液态深层发酵条件的优化[J].食品科学,2009,30(23):377-382

[39] 孙金旭,张卿,朱会霞.优化灵芝真菌发酵条件的研究[J].中国酿造,2008(7):27-29

[40] Zhu LW,Zhong JJ,Tang YJ.Multi-fed batch culture integrated with three-stage light irradiation and multiple additions of copper ions for the hyperproduction of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides by the medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J].Process Biochemistry,2010,45：1904-1911