埃克替尼诱导人结肠癌Caco-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响

张秀艳 石国刚 刘秀艳 葛红娣

(遵化市人民医院,河北 遵化 064200)

结肠癌5年生存率为62％〔1〕。化疗是治疗晚期结肠癌的主要手段之一〔2〕。研究表明，65％～70％的结直肠肿瘤组织中表皮生长因子受体(EGFR)过表达，EGFR信号途径和晚期结直肠癌的进展和转移有一定关系〔3〕。本文观察埃克替尼诱导结肠癌细胞Caco-2的凋亡及对相关凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的影响，旨在进一步观察EGFR对结肠癌及其相关影响机制。

1 材料和方法

1.1材料 Caco-2细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所)；培养于含有10％胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液的(DMEM)完全培养基,在37℃、5％ CO2条件下进行培养, 3 d可基本融合。将Caco-2细胞接种于Transwell板上(孔径0.8 μm), 接种密度为1×104/cm2, 隔天换液；胎牛血清(Gibco, 美国)；Transwell培养板(Cornig,美国), GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)；核转录因子(NF)-κBp65抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化，调节Caco-2细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加入 MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，细胞抑制率=〔(空白对照组 OD 值-各实验组 OD 值)/空白对照组OD值〕× 100％。

1.3结肠癌Caco-2细胞凋亡的检测 收集埃克替尼作用24、48、72 h及空白对照组的细胞 ,调整细胞密度为1×107个/ml,取25 μl的细胞悬液同1 μl的AO/EB染液混匀，吸取10 μl的混合液置于一洁净的载玻片上 ,盖玻片封片后 ,置于荧光显微镜下观察。

1.4Western印迹检测NF-κBp65蛋白水平的表达 收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后-80℃保存备用。SDS-PAGE电泳分离，完毕后将蛋白转移到PVDF膜上。5％脱脂奶粉封闭，后放入含一抗的TBST溶液，4℃过夜，洗膜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，目标蛋白质用DAB显色。计算机扫描，以GAPDH蛋白做参照，分析处理。

1.5统计学分析 采用SPSS13.0软件行t检验。

2 结 果

2.1埃克替尼对结肠癌Caco-2细胞生长的抑制情况 随着埃克替尼对结肠癌Caco-2细胞作用浓度的增加和时间延长，结肠癌Caco-2细胞生长均受到抑制，并呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。24、48、72 h埃克替尼抑制结肠癌Caco-2细胞的IC50值分别为(98.7±9.6)μmol/L,(73.5±6.8)μmol/L和(68.2±5.9)μmol/L，差别有统计学意义(F=44.864 ,P=0.000)。

2.2埃克替尼对结肠癌Caco-2细胞凋亡的影响 10 μmol/L埃克替尼作用24、48、72 h的结肠癌Caco-2细胞凋亡率分别为(8.95±1.11)％，(13.90±1.34)％和(15.4±1.67)％，作用48 h后早期凋亡细胞开始减少，而晚期凋亡和坏死细胞上升，表明埃克替尼对结肠癌Caco-2细胞作用通过早期诱导细胞凋亡继而导致细胞坏死。

2.3Western印迹检测 Icotinib处理组PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8出现裂解片段，且随着Icotinib剂量的增加，裂解片段亦增加，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

结肠癌一般均采用外科手术作为有效的治疗手段。大部分结肠癌由于其症状的不典型和隐匿性，导致大多数患者在确诊时已处于晚期，失去了手术治疗的机会〔4〕。靶向药物是针对靶点的治疗，即使是不同病理类型的肿瘤，只要存在相应的靶点，均可能有效；EGFR在多数上皮来源的肿瘤中均有强弱不同的表达，在结直肠肿瘤中均呈过度表达 , 参与了结直肠癌的发生、发展和转移〔5〕。EGFR 一直是肿瘤治疗的热点，因此发展了多种抗EGFR治疗的药物，包括单克隆抗体- 西妥昔单抗和小分子酪氨酸激酶抑制剂埃克替尼〔6〕。Icotinib是一种口服的EGFR-TKI，主要通过竞争三磷酸腺苷(ATP)结合位点抑制EGFR二聚体的磷酸化，关闭下游信号通路的活化。

本研究结果证实埃克替尼通过诱导结肠癌Caco-2细胞的凋亡发挥其抗肿瘤作用。肿瘤的增生主要取决于细胞的增生和凋亡引起的细胞死亡〔6〕。凋亡机制的减弱或障碍可导致肿瘤的发生，同样，通过诱导细胞凋亡对肿瘤的消除起到一定的积极作用。在细胞死亡途径中，首先激活的是启动型Caspase，如Caspase-8 Caspase-9，而后通过级联放大过程激活执行型Caspase，如Caspase-3 Caspase-7等，最终特异性地裂解其底物即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，使 细 胞 发 生 生化及形态学改变，导致细胞凋亡〔7〕。埃克替尼处理组显著诱导PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解。本实验证实，埃克替尼通过促进PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解，诱导结肠癌Caco-2细胞的凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。

4 参考文献

1Jemal A, Siegel R, Ward E,etal.A study on alkaline heat treated MgCa alloy for the control of the biocorrosion rate〔J〕.Acta Biomater,2009；5(7):2790-9.

2Sileri P，Dugo S，Bennavoli D，etal.Metachronous splenicmetastasis from colonic carcinoma five years after surgery：a case report and literature review〔J〕.South Med J，2009；102(7)：733-5.

3Abdelall HS, Mishriky AM, Mohamed FA,etal.Epidermal growth factor receptor in colorectal carcinoma: correlation with clinical pathological prognostic factors〔J〕.Colorectal Dis, 2008；10(2):170-8.

4Skvortsov S,Sarq B,Lindner H,etal.Cetuximab inhibits thymidylate synthase in colorectal cells expressing epidermal growth factor receptor〔J〕.Proteomics Clin Appl, 2008；2(6):908-14.

5徐 玲，张 晗，曲秀娟,等.埃克替尼提高胃癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性〔J〕.现代肿瘤医学,2013;6(21):1174-7.

6Korsmeyer SJ.Bcl-2:a repressor of lymrphocyte death 〔J〕.Human Today, 1992;13(2):285-8.

7Munoz-Pinedo C.Signaling pathways that regulate life and cell death: evolution of apoptosis in the context of self -defense〔J〕.Adv Exp Med Biol，2012;738(1):124-43.