内皮素1基因rs5370多态性与海南汉族老年脑梗死的关联性

黄 达 黄志萍 冯清春 胡少敏 曹桂芬 王兴文 吴碧莹 吴 恳 苏春妮 孙 悦

(海口市第三人民医院，海南 海口 571100)

高血压、心脏病、糖尿病、高血脂、高血黏度等因素通过影响血液成分变化及血流动力学变化而导致血栓形成，发生脑梗死，而遗传因素也是脑梗死发生的重要影响因素之一〔1～3〕。内皮素(ET)是血管收缩性物质，对调节心血管功能、维持基础血管张力及心血管系统的稳定性具有重要作用。ET-1是迄今为止发现的收缩功能最强的内源性物质，其增高不仅与脑梗死的发病有关，与其发展过程也有密切关系〔4〕。遗传多态性是影响蛋白质结构及表达水平的重要因素，也是疾病发生的基础。ET-1存在遗传多态性，其中rs5370G/T是内皮素前体蛋白198位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺的多态位点。本研究拟探讨该位点的突变是否与海南汉族老年脑梗死存在关联。

1 资料与方法

1.1一般资料 (1)对照组：无血缘关系的海南汉族健康个体156例，肝肾功能正常，排除糖尿病、心脑血管疾病、血液病史。对照组中男97例，女59例,年龄>60岁，平均68.7岁。(2)实验组：海南省汉族脑梗死患者150例，所有病例均经头部CT扫描确诊为脑梗死，并且符合第四届脑血管病学术会议修订的“各类脑血管病诊断要点”中相关诊断标准。男92例，女57例，年龄>60岁，平均69.3岁。所有实验组患者均排除心源性脑栓塞、有严重先天性心、肝、肾和造血系统疾病者、合并恶性肿瘤患者。两组患者年龄、性别比例及体重等一般体征无显著差异，存在可比性(P>0.05)。

1.2基因多态性的检测 ①基因组DNA提取：所有入选者采集EDTA抗凝血3 ml，利用北京天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取基因组DNA。②基因序列的获得及引物设计：从GenBank中获取人类ET-1编码基因，并获得rs5370的位点信息〔TTTCATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA(G/T)CCCTCCAGAGAGCGTTATGTGACCC〕。根据以上信息在rs5370位点两侧设计两个引物(P1:GTCGGAGACCATGAGAAACAG，P2:TCAGGAACCAGCAGAGGATGC)，引物扩增片段的长度为220 bp。③PCR扩增体系及条件：每管在1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.2～0.5 μmol/L，4种dNTP各100 μmol/L,Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)1 U，扩增体系为15 μl。PCR循环参数：95℃预变性3 min，之后进行11个循环反应(每个循环包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循环完成后72℃温育30 s，接着进行24个循环反应(每个循环包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循环完成后72℃温育3 min。④PCR产物的纯化:PCR扩增后取3 μl PCR产物用ExoI和FastAP纯化。⑤SNP分型：利用延伸引物TTTTTTTTTATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA进行延伸反应，取1 μl延伸产物，加8 μl上样缓冲液，95℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪进行分型。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0软件基因频率采用基因计数法计算。频率比较用χ2检验，计量资料用t检验。

2 结 果

两组中均可检测出GG、GT、TT三种基因型，三种基因型在实验组中的分布频率分别为79例(52.7％)、54例(36％)、17例(11.3％)，在对照组中的分布频率分别为121例(68％)、47例(26.4％)、10例(5.6％)，组间基因型分布频率存在明显差异(χ2=8.79，P=0.012)。GG在实验组中的分布频率明显低于对照组(χ2=8.01，P=0.005)，而TT或者GT在组间的分布则无显著差异 (P>0.05)。等位基因G和T在实验组的分布频率分别为212例(70.7％)、88例(29.3％)，在对照组中的分布频率分别为289例(81.2％)、67例(18.8％)，统计学分析结果显示组间差异显著(χ2=9.97，P=0.001)。

3 讨 论

ET对心血管系统的稳定性具有重要作用，而目前发现的三类ET中，ET-1被发现收缩功能最强。成熟的ET-1仅有21个氨基酸，是由含有200个氨基酸的巨大前体经加工编辑而来。rs5370是ET前体分子中198位密码子的多态性位点，该位点若为G则对应的氨基酸为赖氨酸，若为T则对应的是天冬酰胺。Raymond等〔5〕于2013年提出赖氨酸非共价修饰在机体正常生命过程中的重要性，认为该修饰可能与机体的正常生命活动密切相关，而赖氨酸的突变则可能导致疾病的发生。杭丽玮等〔6〕探讨了该位点与高血压缺血性脑卒中的关系，结果显示其基因型频率和等位基因频率在脑卒中组和对照组之间有统计学差异，基因型频率的相对风险分析发现，GT+TT基因型患脑卒中的风险是GG基因型的4.855倍。

本研究结果说明，基因型GG可能是海南汉族老年人群心脑血管的保护因素，而等位基因T则可能是海南汉族老年人群脑梗死的易感基因。

4 参考文献

1Ueda N,Satoh S,Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma〔J〕. The Neurologist,2011;17(1):34-7.

2杨发满.老年脑梗死患者血栓调节蛋白及IL-6水平〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(18)：4573-4.

3李红娟,李 庆.脑梗死患者相关危险因素分析〔J〕.中国卫生检验杂志,2013;2:487-8,491

4刘静波.急性脑梗死患者血浆内皮素表达水平的临床研究〔J〕.中华全科医学,2013;8:1329-30.

5Moellering RE,Cravatt BF. Functional lysine modification by an intrinsically reactive primary glycolytic metabolite〔J〕．Science，2013;341(6145)：549-53.

6杭丽玮,周建中,王 珍,等.内皮素-1基因多态性与高血压缺血性卒中的关系〔J〕.西南大学学报(自然科学版),2009;1：116-21.