活性氧在血管外膜成纤维细胞表型转化、增殖、迁移及胶原分泌过程中的作用

高 媛 孔卫娜 张 铎 李 雪 李 楠 柴锡庆

(河北医科大学生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

近期研究证明血管外膜中的主要细胞成分血管外膜成纤维细胞(VAF)对多种刺激具有应答能力，被激活后获得α-平滑肌肌动蛋白(SM-actin)的表达特征，转化为肌成纤维细胞(MF)表型，然后可向中膜和新生内膜迁移、增殖，同时大量合成胶原纤维，参与血管重塑过程。VAF的表型转化、增殖、迁移及胶原纤维的合成在动脉粥样硬化、高血压和血管介入治疗后再狭窄等多种心血管疾病的发生中发挥重要作用〔1〕。活性氧(ROS)可以增强血管平滑肌细胞的增生，导致内皮细胞功能和结构障碍，促进单核-巨噬细胞游移，促进细胞外基质降解等作用〔2，3〕。此外，ROS在VAF向MF细胞表型转化、增殖、迁移及胶原纤维的合成过程中也发挥重要作用。本文就血管ROS的生成及ROS促进VAF型转化、增殖、迁移及胶原纤维合成的作用机制进行综述。

1 血管ROS的生成

ROS主要包括超氧阴离子(·O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、单线态氧(1O2)等。在血管系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶是ROS的主要来源。NADPH氧化酶是由多个亚单位组成的跨膜复合物，包括跨膜亚单位p22phox(调节亚基)、gp91phox(催化亚基)和胞质亚单位p47phox、p67phox及小G蛋白Rac。其中，gp91phox有5种同系物，命名为Nox1-5，gp91phox即Nox2。内皮细胞、中膜的平滑肌细胞、外膜成纤维细胞均有NADPH氧化酶的表达。当血管受到各种内外因素的刺激后，可诱导p47phox的磷酸化，p47phox的磷酸化促进胞质亚单位向细胞膜的易位并与跨膜亚单位p22phox相结合，进而导致gp91phox的催化活性被激活，将两个电子传递给氧分子产生·O2-。·O2-存在的时间很短，很快在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下代谢为H2O2。·O2-和H2O2在铁的催化下还可以通过Fenton反应转化为反应性极强的·OH〔4，5〕。

诱导血管ROS生成的因素很多，如血管机械性牵拉或损伤(如动脉套管或球囊损伤〔6～8〕)、缺氧〔9〕、机体代谢异常造成的血糖〔10〕、血脂升高〔11〕均可通过激活NADPH氧化酶诱导ROS的生成。此外，各种病理因素导致的机体内细胞因子、激素等水平的改变也可诱导ROS的生成。AngⅡ可激活所有类型血管细胞中的NADPH氧化酶，促进ROS的生成〔12，13〕。近期研究〔14～17〕表明动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、高血压等疾病过程与转化生长因子(TGF)-β1有着密切的联系。TGF-β1表达的异常升高是促使血管重塑的主要因素之一〔14〕。TGF-β1也可以激活所有类型血管细胞中的NADPH氧化酶，促进ROS生成〔15～17〕。

2 ROS促进VAF的表型转化、增殖、迁移及胶原纤维的合成

2.1ROS促进VAF的表型转化 ROS水平的升高在VAF/MF的表型转化过程发挥重要作用。例如，AngⅡ诱导VAF ROS的生成可以导致α-SM-actin表达的升高，促进VAF向MF的表型转化；相反，用自由基清除剂(NAC)清除ROS，或用NADPH氧化酶抑制剂(DPI)抑制NADPH氧化酶的活性，或通过转染gp91phox的反义小核苷酸片段抑制NADPH氧化酶催化亚基的表达，减少ROS的生成，均可以抑制VAF向MF的表型转化，使α-SM-actin的表达降低〔18〕。进一步研究发现，AngⅡ诱导ROS生成后可导致p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和C-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平升高，p38 MAPK/JNK信号通路被激活，促进α-SM-actin的表达，导致VAF/MF的表型转化。相反，用DPI或gp91phox的反义小核苷酸片段抑制NADPH氧化酶的活性，降低AngⅡ诱导的ROS的生成，或用N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除生成的ROS，均可降低p38 MAPK和JNK的磷酸化水平，α-SM-actin的表达也随之下降，VAF/MF的表型转化同时受到抑制；若用p38MAPK的抑制剂(SB202190)或JNK的抑制剂(SP600125)同样能够降低AngⅡ诱导的α-SM-actin的表达〔18〕。上述研究证实，在AngⅡ诱导的VAF/MF的表型转化过程中，NADPH氧化酶-ROS-p38 MAPK/JNK信号通路发挥了重要作用。

TGF-β1也可通过促进ROS的生成诱导VAF向MF的表型转化。郭淑杰等〔19〕采用寡核苷酸芯片技术动态检测VAF表型转化过程中基因表达的变化，发现在此过程中NADPH氧化酶表达显著升高，说明NADPH氧化酶及其生成的ROS可能参与TGF-β1诱导的VAF的表型转化过程。Fleenor等〔17〕研究证实了上述推测，用TGF-β1处理体外培养的VAF，VAF内ROS水平升高的同时，α-SM-actin的表达显著增加；相反，用小干涉RNA(siRNA)抑制NADPH氧化酶的表达，细胞ROS的水平降低，可显著削弱TGF-β1诱导的VAF α-SM-actin的生成，VAF/MF的表型转化受到抑制，上述研究证实ROS在TGF-β1诱导的VAF/MF表型转化过程中发挥重要作用。进一步研究发现，TGF-β1诱导的VAF ROS的生成可以导致细胞内信号分子Smad2和Smad3磷酸化水平升高；相反，抑制NADPH氧化酶的表达，降低ROS水平，TGF-β1诱导的Smad2和Smad3的磷酸化水平显著降低；若用反义小核苷酸片段抑制Smad2和Smad3的表达，TGF-β1诱导的VAF/MF的表型转化同样受到抑制〔20，21〕。

2.2ROS促进VAF的增殖 细胞研究发现，用TGF-β1处理原代培养的主动脉VAF 24 h后，细胞内ROS水平显著升高，同时VAF增殖显著增加，并且检测到细胞内Smad2、Smad3及磷酸化的Smad2、Smad3水平显著升高；相反，用反义小核苷酸片段抑制Smad2和Smad3的表达，可抑制TGF-β1诱导的VAF增殖〔21〕。上述研究证实，ROS-Smads 2/3信号通路在TGF-β1诱导的VAF增殖过程中同样发挥重要作用。

除此之外，研究还证实血管损伤或缺氧也可诱导ROS的生成，促进VAF增殖。血管损伤导致猪冠状动脉VAF内ROS水平升高，并显著促进了VAF的增殖；相反，用抗氧化剂(Tiron、Catalase)清除ROS，或用DPI抑制NADPH氧化酶的活性，减少ROS的生成，均可显著抑制血管损伤导致的VAF的增殖〔7〕。缺氧也可以上调肺动脉VAF NADPH氧化酶的表达，使ROS水平升高，诱导肺动脉VAF的异常增殖；用siRNA技术抑制肺动脉VAF NADPH氧化酶的表达，降低ROS的生成，可抑制缺氧诱导的肺动脉VAF的异常增殖〔22〕。

2.3ROS促进VAF的迁移 ROS在VAF转化为MF后向中膜和新生内膜迁移的过程中同样发挥重要作用。利用转膜腔(Transwell Chamber)培养大鼠主动脉VAF，用AngⅡ进行处理，检测结果发现，AngⅡ可显著促进体外培养的大鼠主动脉VAF的迁移，同时检测到细胞内ROS水平的升高；相反，抑制内源性NADPH氧化酶的表达，降低细胞内ROS水平，可削弱AngⅡ诱导的VAF的迁移〔23〕。进一步的研究发现，用SB202190几乎能够完全阻断AngⅡ诱导的VAF迁移活动〔24〕。上述研究结果提示NADPH氧化酶-ROS-P38MAPK信号转导途径可能在AngⅡ诱导的VAF迁移过程中发挥重要作用。

体外培养大鼠胸主动脉VAF，用TGF-β1进行处理，Transwell Chamber测试细胞迁移能力，结果显示随着TGF-β1浓度或作用时间的增加，诱导迁移的VAF细胞数目逐渐增加，同时检测到细胞内ROS水平的逐渐升高；相反，抑制NADPH氧化酶的活性，降低细胞ROS水平，可显著削弱TGF-β1诱导的VAF迁移活动。进一步研究发现，TGF-β1诱导VAF ROS生成，促进其迁移活动发生的同时，细胞内Smad2、Smad3、磷酸化Smad2、Smad3水平也显著提高；若抑制Smad2和Smad3的表达，可显著抑制TGF-β1诱导的VAF的迁移〔21〕。上述结果证实，在TGF-β1促进VAF迁移的过程中同样涉及ROS-Smads 2/3信号通路。

2.4ROS促进VAF胶原纤维的合成 VAF经向MF的表型转化及向内膜迁移、增殖的同时，分泌的胶原纤维增加，尤其是Ⅰ型胶原蛋白分泌增多，并在血管外膜和新生内膜沉积，导致血管纤维化，血管管腔缩窄等病理性血管重塑的发生。An等〔25，26〕研究显示，AngⅡ诱导的VAF ROS水平的升高会促进VAFⅠ型胶原的分泌；相反，使SOD基因过表达，或者用SOD、四甲基哌啶(Tempol)或肽铁试剂(Tiron)清除过量的ROS，或用DPI抑制NADPH氧化酶的活性，或将gp91phox的基因敲除，使VAF内ROS的生成减少，均可抑制AngⅡ诱导的VAFⅠ型胶原的合成。上述研究证实，ROS在AngⅡ诱导的VAFⅠ型胶原的合成过程中发挥重要作用。An等〔25，26〕研究进一步发现，AngⅡ通过诱导VAF ROS生成后，首先促进内皮素(ET)-1的分泌，ET-1与其受体(ETA)结合后，再进一步促进VAFⅠ型胶原的合成；相反，过表达SOD基因，或用SOD、Tempol或Tiron清除过量的ROS，或用Apocynin或DPI抑制NADPH氧化酶的活性，或将gp91phox的基因敲除，降低ROS的生成，ET-1 mRNA和蛋白的表达均受到抑制，Ⅰ型胶原的合成也随之降低；若用ETA的拮抗剂(BQ-123)抑制ET和ETA的相互作用，也可抑制AngⅡ诱导的VAFⅠ型胶原的合成。上述研究证实AngⅡ通过激活VAF NADPH氧化酶，诱导ROS的生成，促进ET-1的合成和分泌，ET-1又通过自分泌的方式和其受体ETA相作用，诱导Ⅰ型胶原的合成。

TGF-β1也可通过诱导VAF ROS的生成促进胶原纤维的合成，使血管的弹性降低，硬度增加〔17〕，这其中也涉及Smads 2/3信号通路〔21〕。

3 总结及展望

目前，研究已经证实一些药物可以通过其抗氧化作用抑制VAF的表型转化、增殖、迁移以及细胞外基质的分泌，改善动脉粥样硬化、高血压和介入治疗后再狭窄等疾病的病理性血管重塑〔27〕。例如，抗坏血酸(AA)可通过其抗氧化作用显著抑制NO诱导的VAF增殖〔28〕。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ激动剂可抑制AngⅡ诱导的大鼠胸主动脉VAF ROS的生成，并抑制AngⅡ诱导的VAF的迁移活动和Ⅰ型胶原纤维的分泌〔29〕。老年C57BL6小鼠在服用氧自由基清除剂3 w后，动脉ROS的水平显著降低，VAFⅠ型胶原的分泌显著减少，老年鼠动脉硬化的程度也有所缓解〔30〕。因此，对ROS在血管重塑病变中的作用机制的深入研究将为心血管疾病的临床治疗提供重要的理论支持。

4 参考文献

1Sartore S,Chiavegato A,Faggin E,etal.Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling：from innocent bystander to active participant〔J〕.Circ Res,2001;89(12)：1111-21.

2Haurani MJ,Pagano PJ.Adventitial fibroblast reactive oxygen species as autacrine and paracrine mediators of remodeling：bellwether for vascular disease〔J〕.Cardiovasc Res,2007；75(4)：679-89.

3盛 林,刘亚军,潘其兴.活性氧诱导介入损伤后血管平滑肌细胞凋亡和增殖的氧化还原机制〔J〕.中国老年学杂志,2001；21(5):400-2.

4Bengtsson SH,Gulluyan LM,Dusting GJ,etal.Novel isoforms of NADPH oxidase in vascular physiology and pathophysiology〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2003；30(11)：849-54.

5Chamseddine AH,Miller FJ Jr.Gp91phox contributes to NADPH oxidase activity in aortic fibroblasts but not smooth muscle cells〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(6)：H2284-9.

6Souza HP,Souza LC,Anastacio VM,etal.Vascular oxidant stress early after balloon injury,da Luz PLy：evidence for increased NAD(P)H oxidoreductase activity〔J〕.Free Radic Biol Med,2000;28(8)：1232-42.

7Shi Y,Niculescu R,Wang D,etal.Increased NAD(P)H oxidase and reactive oxygen species in coronary arteries after balloon injury〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001；21(5):739-45.

8Oeckler RA,Kaminski PM,Wolin MS.Stretch enhances contraction of bovine coronary arteries via an NAD(P)H oxidase-mediated activation of the extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase cascade〔J〕.Circ Res,2003；92(1)：23-31.

9Liu JQ,Zelko IN,Erbynn EM,etal.Hypoxic pulmonary hypertension：role of superoxide and NADPH oxidase(gp91phox)〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006；290(1)：L2-10.

10Inoguchi T,Li P,Umeda F,etal.High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C--dependent activation of NAD(P)H oxidase in cultured vascular cells〔J〕.Diabetes,2000；49(11)：1939-45.

11Warnholtz A,Nickenig G,Schulz E,etal.Increased NADH-oxidase-mediated superoxide production in the early stages of atherosclerosis：evidence for involvement of the renin-angiotensin system〔J〕.Circulation,1999；99(15):2027-33.

12Seshiah PN,Weber DS,Rocic P,etal.Angiotensin Ⅱ stimulation of NAD(P)H oxidase activity：upstream mediators〔J〕.Circ Res,2002；91(5)：406-13.

13Rueckschloss U,Duerrschmidt N,Morawietz H.NADPH oxidase in endothelial cells：impact on atherosclerosis〔J〕.Antioxid Redox Signal,2003；5(2):171-80.

14李 郁,罗兴林.转化生长因子-α与血管重构关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2009；29(4)：497-9.

15Buday A,Orsy P,Godó M,etal.Elevated systemic TGF-beta impairs aortic vasomotor function through activation of NADPH oxidase-driven superoxide production and leads to hypertension,myocardial remodeling,and increased plaque formation in apoE(-/-)mice〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010；299(2):H386-95.

16Sturrock A,Cahill B,Norman K,etal.Transforming growth factor-beta1 induces Nox4 NAD(P)H oxidase and reactive oxygen species-dependent proliferation in human pulmonary artery smooth muscle cells〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006；290(4):L661-73.

17Fleenor BS,Marshall KD,Durrant JR,etal.Arterial stiffening with ageing is associated with transforming growth factor-β1-related changes in adventitial collagen：reversal by aerobic exercise〔J〕.J Physiol,2010；588(Pt 20):3971-82.

18Shen WL,Gao PJ,Che ZQ,etal.NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species regulate angiotensin-II induced adventitial fibroblast phenotypic differentiation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006；339(1)：337-43.

19郭淑杰，吴凌云，沈伟利，等.血管外膜肌成纤维细胞分化的基因表达谱〔J〕.生理学报，2006；58(4)：337-44.

20Cucoranu I,Clempus R,Dikalova A,etal.NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts〔J〕.Circ Res,2005；97(9)：900-7.

21Ren M,Wang B,Zhang J,etal.Smad2 and Smad3 as mediators of the response of adventitial fibroblasts induced by transforming growth factor β1〔J〕.Mol Med Report,2011；4(3):561-7.

22Li S,Tabar SS,Malec V,etal.NOX4 regulates ROS levels under normoxic and hypoxic conditions,triggers proliferation,and inhibits apoptosis in pulmonary artery adventitial fibroblasts〔J〕.Antioxid Redox Signal,2008；10(10)：1687-98.

23Haurani MJ,Cifuentes ME,Shepard AD,etal.Nox4 oxidase overexpression specifically decreases endogenous Nox4 mRNA and inhibits angiotensin Ⅱ-induced adventitial myofibroblast migration〔J〕.Hypertension,2008；52(1):143-9.

24Li L,Zhu DL,Shen WL,etal.Increased migration of vascular adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensive rats〔J〕.Hypertens Res,2006；29(2)：95-103.

25An SJ,Boyd R,Wang Y,etal.Endothelin-1 expression in vascular adventitial fibroblasts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006；290(2)：H700-8.

26An SJ,Boyd R,Zhu M,etal.NADPH oxidase mediates angiotensin Ⅱ-induced endothelin-1 expression in vascular adventitial fibroblasts〔J〕.Cardiovasc Res,2007；75(4)：702-9.

27Di Wang H,Rätsep MT,Chapman A,etal.Adventitial fibroblasts in vascular structure and function：the role of oxidative stress and beyond〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2010；88(3)：177-86.

28Gregory EK,Vavra AK,Moreira ES,etal.Antioxidants modulate the antiproliferative effects of nitric oxide on vascular smooth muscle cells and adventitial fibroblasts by regulating oxidative stress〔J〕.Am J Surg,2011；202(5):536-40.

29Zhang J,Fang NY,Gao PJ,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate angiotensin Ⅱ-induced collagen type Ⅰ expression in adventitial fibroblasts〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2008；35(1)：72-7.

30Fleenor BS,Seals DR,Zigler ML,etal.Superoxide-lowering therapy with TEMPOL reverses arterial dysfunction with aging in mice〔J〕.Aging Cell,2012；11(2)：269-76.