铁皮石斛原球茎分化的研究概述

张寿文，苏慧慧

(江西中医药大学，江西 南昌330004)

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张寿文，教授，研究方向：中药资源与开发;Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com

铁皮石斛原球茎分化的研究概述

张寿文*，苏慧慧

(江西中医药大学，江西 南昌330004)

综述国内对铁皮石斛原球茎分化组织培养进行的深入研究，系统查阅国内近5年的文献20余篇。从培养基，激素，附加物等多个条件进行了概述，并提出了存在的问题及相应对策。

铁皮石斛；原球茎；分化

铁皮石斛Dendrobiumofficnale为多年生草本，属附生兰类，因其老茎外呈黑色，又名为黑节草，是常用的名贵中药[1]，所含的主要成分为石斛多糖，具有提高人体白细胞，增加机体免疫力等功能[2]。但由于生长环境特殊，以及长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。同时，铁皮石斛种子极小，无胚乳，自然条件下需要某些真菌共生才能萌发，繁殖比较慢，且植株生长不一致，抗病虫害能力差[1]。因此通过组织培养技术,使它在人工干涉的条件下大量繁殖，以保护种质资源，缓解供求的紧张局面，是保护和利用铁皮石斛资源的重要途径。自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来,石斛组织培养逐步走向深入化[3]。组织培养获得铁皮石斛再生植株的途径有多种。用成熟的种子消毒后进行无菌播种形成原球茎，并经过增殖分化发育成完整植株只是其中一种。也可通过选择适宜的外植体(茎段、茎尖、幼芽、叶片等)诱导形成拟原球茎或丛生芽来实现快繁以解决铁皮石斛资源紧缺问题[4]。其中原球茎的分化是铁皮石斛组织培养的一个很重要的环节，笔者对近些年来有关铁皮石斛原球茎分化作一简单的概述。

1 原球茎分化

影响原球茎分化的主要有原球茎的大小、生理状态、培养基的类型、激素种类和比例、天然添加物以及其他一些因素。

1.1 原球茎的大小

原球茎的大小常以其长度表示，随着原球茎的长大，其顶部分化能力增强，形成芽较多，原球茎上增殖的新原球茎数增加。短小的原球茎分化能力差，其分化形成的芽在随后的培养中常常枯死或再形成新原球茎[5]。因此诱导原球茎分化时，应选用增殖旺盛，生长粗壮，长度达到1 cm以上的原球茎。

1.2 生理状态

不同的生理状态对石斛原球茎分化有很大的影响，张艳等[6]发现颜色翠绿形态饱满、组织致密的原球茎有利于分化，趋向衰老的原球茎,其表面分生中心褐化脱落,顶部亦无芽形成。

1.3 培养基

培养基是组织培养中最重要的基质，选择合适的培养基是组织培养的首要环节。常用的培养基有MS培养基，B5培养基，N6培养基，ER培养基等。邵世光等[7]在2009年以铁皮石斛拟原球茎为外植体，在基本培养基N6中对6-BA(6-苄基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)及pH值三因素采用L9(34)正交试验表进行正交试验，研究其对原球茎分化的影响。50 d后统计试验结果，在基本培养基N6中，当6-BA的浓度为2 mg·L-1、IBA浓度为0.2 mg·L-1、pH值为5.8时,原球茎最易于分化成丛生小苗。杨立昌等[8]发现铁皮石斛愈伤组织在1/2 MS培养基上的出芽率比MS培养基好，说明低盐培养基有利于不定芽的分化。而李荣珍[9]的研究表明不同培养基对铁皮石斛原球茎的分化有明显差异，其顺序依次为改良MS>N6>MS>1/2N6>1/2改良MS>1/2MS，以改良MS培养基最好。李莹等[10]对比了MS，1/2 MS，B5，N6培养基对腋芽的诱导效果，以MS培养基长势较好。

1.4 激素种类和比例

一般高浓度的细胞分裂素有利于诱导芽的发生，而高浓度的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)对愈伤组织的诱导形成有促进作用。赵兴兵等[11]考察了不同浓度的6-BA，NAA(萘乙酸)和香蕉汁对原球茎分化的影响，三者配比使用，明显促进原球茎分化，优选出最适于原球茎分化的激素浓度配比为6-BA 1.5 mg·L-1+NAA l.2 mg·L-1+5%香蕉汁的MS培养基。李丹等[12]认为，当培养基中不含激素时，原球茎的出芽率为0，添加一定浓度的KT(N6-呋喃甲基腺嘌呤)和NAA后，出芽率增大，随着NAA浓度增加，出芽率也显著增大。杨柳平等[13]通过试验对比发现，只有NAA、6-BA和KT配合使用才能有效的促进铁皮石斛原球茎的分化，且分化效果较好，而过高或过低浓度的激素配比均不利于铁皮石斛原球茎的分化。邵世光等[7]运用正交试验设计研究原球茎的分化，30 d左右，每个原球茎的茎顶均长出2～3片幼叶。极差分析表明，IBA浓度为0.12 mg·L-1，6-BA的浓度为2 mg·L-1、pH值为5.18时最易使原球茎分化成丛生小苗。

1.5 有机添加物

有机添加物由于含有许多复杂、有效的成分而广泛应用于兰科植物的组织培养[14]。椰子、香蕉、马铃薯等是作为较常见的附加物添加到培养基中的，基本原理是：其中可能含有某种人类尚未知道的物质，且这些物质对植物在生根壮苗中起一定的作用。蒋波等[15]认为：香蕉提取液在铁皮石斛的苗的形态建成中是作用效果较好的一种附加物，对铁皮石斛的生根壮苗的效果明显优于其它的附加物。杨柳平等[13]研究发现，在适宜的激素配比培养基中添加土豆汁的原球茎分化率均高于不添加任何激素或其他添加物(CK)培养基，而添加香蕉汁的培养基其分化率均低于不加任何添加物(CK)的培养基，可见土豆汁能有效促进铁皮石斛原球茎的分化，但香蕉汁对原球茎的分化明显有抑制作用。谢启鑫等[16]将增殖后的原球茎团，接种于1/2 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+20%马铃薯提取液的培养基上诱导丛芽，约15 d开始分化出丛生芽，40 d时芽高可达1～2 cm。魏梅娟等[17]以椰汁作为附加物发现在6-BA 4 mg·L-1，NAA 0.1 mg·L-1时有利于铁皮石斛组培苗的继代培养。

1.6 其它影响因素

除了外植体、培养基、激素、天然附加物影响外,光照、温度以及pH等也会影响原球茎的分化。铁皮石斛组培常用的温度为(25±1)℃，光强1 600～2 000 lx，日照光12 h，pH为5.0～5.5。在培养的过程中很容易出现褐化现象，最常见的做法就是及时更换培养基；在培养基中添加抗氧化剂等。

2 问题与展望

目前在铁皮石斛原球茎分化的研究中，绝大多数采用固态静止培养法，而对液体静止培养和液体转动培养的研究甚少。液体培养易于植物体通过水势原理来吸收营养成分，比较直接，而且液体中营养成分分布均匀，使整个原球茎都能充分地吸收养分；在固体培养基内培养，其营养成分在培养基上下分布不十分均匀，且原球茎只有固着部分具有吸收能力，因此大大减少了原球茎吸收养分的面积，吸收的速度比较有限[18]。因此液体培养法也将是广大学者今后探索的一个重要方向。

近年来对石斛的研究大多集中在石斛的种子萌发，试管苗生长条件(如何选用外植体、培养基、激素、温度、光强、pH值、外源添加物)等方面，而对石斛的炼苗、室外移栽以及石斛如何走向产业化研究较少。另外，石斛在自然传粉的条件下结果率只有17.3%，人工授粉尽管可以使石斛的结果率提高到72.1%～100%[19]，但实际操作过程中既费时又费力。人工种子是一个不错的选择，目前主要以萌发原球茎为繁殖体，用海藻酸钠包裹，在铁皮石斛外层制作包衣，自然条件下可获得较高的萌发率和成活率[20]。但人工种子能够大规模生产、贮藏和迅速推广良种的优越性，使得人工种子的研究和应用仍然具有十分诱人的前景。

在野生植物资源遭到严重破坏的今天，为了达到石斛资源的可持续利用和发展，需要多方面共同努力，不仅要重视石斛的组织培养，也要注重天然产物的开发与利用，探索其活性成分的作用机制和构效关系，为进一步的化学合成提供参考。

[1] 莫昭展,贝学军，杨小飞，等.铁皮石斛丛生芽增殖研究[D].西北林学院学报，2008，23(6)：104-107.

[2] 朱艳，秦民坚. 铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究[J]. 中国野生植物资源，2003，22(2)：56-57.

[3] 张明，夏鸿西，朱利泉，等.石斛组织培养研究进展[J].中国中药杂志，2000，26(6)：323-326.

[4] 温明霞，聂振朋，林媚,等.铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展[J].广西农业科学，2007，38(3)：227-229.

[5] 张菊野，俞玲凤,连宏坤.几种影响春兰原球茎生长与分化的因素[J].植物生理学通讯[J]，1993，29(3)：175-178.

[6] 张艳,钱忠英,陈军峰,等.影响霍山石斛生长的若干因素[J].上海师范大学学报(自然科学版)，2009，38(4)：408-413.

[7] 邵世光，侯北伟,周琪，等.基于正交实验法的铁皮石斛原球茎分化和生根条件研究[D].南京师大学报(自然科学版)，2009，32(4)：98-102.

[8] 杨立昌,乙引，张宇斌，等.铁皮石斛快速繁殖体系研究[J].北方园艺，2010(22)：136-138.

[9] 李荣珍.铁皮石斛种子试管苗的快速繁殖研究[J].广东农业科学，2012(14)：22-24.

[10] 李莹.铁皮石斛组培快繁技术[J].林业技术开发，2012，26(1)：96-99.

[11] 赵兴兵,吴维佳，庞璐，等.珍稀濒危药材铁皮石斛组培快繁关键技术研究[D].湖南中医药大学学报，2012，32(3)：27-30.

[12] 李丹，王馨彩，尹明华.黑节铁皮石斛原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究[D].上饶师范学院学报，2010，30(6)：74-78.

[13] 杨柳平，刘畅庆,赵仁发，等.铁皮石斛种子诱导原球茎组培快繁体系的研究[J].广东农业科学，2012(7)：54-57.

[14] 张超，张茜茜，楼楠男，等.有机添加物对大花蕙兰原球茎及幼苗生长发育的影响[J].安徽农业科学，2009，37(19)：8866-8868.

[15] 蒋波,杨存亮，黄婕，等.铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究[J].玉林师范学院学报(自然科学)，2005,26(3)：66-69.

[16] 谢启鑫,宋小明，黄东华，等.铁皮石斛的种子培养[J].北方园艺，2010(8)：90-91.

[17] 魏梅娟,李雪，叶青梅，等.铁皮石斛组培苗生长的影响因素研究[J].北方园艺，2011(2)：146-148.

[18] 沐德俊.霍山石斛原球茎在不同培养方式下生长状态的研究，2011(3)：19-21.

[19] 程式君.石斛的人工授粉[J].中国科学院华南植物研究集刊，1986(3)：46.

[20] 曾颖苹,朱乾坤，王万军.铁皮石斛人工种子包衣研究[J].北方园艺，2012(17)，155-158.

StudiesonProtocormDifferentiationofDendrobiumofficnale

ZHANGShouwen*,SUHuihui

(JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Summary the protocorm differentiation ofDendrobiumofficnaletissue culture in China,and comprehensive inquiry the past five years domestic literature,more than 20 articles.The culture medium,hormones,additives,and other conditions are outlined,and put forward the existing problems and the corresponding countermeasures.

Dendrobiumofficinale;Protocorm;Differentiation

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.003

2013-06-27)