固体培养铁皮石斛原球茎化学成分研究△

陈晓梅，杨峻山，郭顺星，孟志霞

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

专 题

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09301002-001-031)

*

郭顺星，研究员，博士生导师，研究方向：珍稀濒危药用植物菌根生物学；Tel：(010)62829619，E-mail：sxguo1986@163.com

固体培养铁皮石斛原球茎化学成分研究△

陈晓梅，杨峻山，郭顺星*，孟志霞

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的研究固体培养的铁皮石斛原球茎的化学成分。方法利用硅胶、葡聚糖凝胶柱色谱法，分离化学成分，根据理化性质和MS、NMR等技术对化合物进行结构鉴定。结果从固体培养的铁皮石斛原球茎甲醇提取物中分离鉴定了8个化合物，分别为：3-羟基-24-亚甲基-环羊毛脂烷(1)，3，5-二羟基-24-甲基-环羊毛脂烷(2)，3，5-二羟基-环羊毛脂烷(3)，β-谷甾醇(4)，豆甾醇(5)，N-阿魏酰基酪胺(6)，反式对羟基桂皮酸(7)和阿魏酸(8)。结论化合物1,2,3和6均为首次从石斛属植物中分离得到。

铁皮石斛原球茎；固体培养；化学成分

兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是中药铁皮石斛的唯一来源植物。铁皮石斛生长缓慢，自然繁殖率低，加之人为的过度采挖和对其生境的破坏，导致铁皮石斛的野生资源已经濒临枯竭。人工栽培生产是目前铁皮石斛相关保健品及药品所使用的原料药的主要来源。原球茎(protocorm)是种子萌发时种胚吸水膨大，突破种皮后形成的球形原胚。铁皮石斛原球茎是利用种子人工繁育生产种苗的起点，具有增殖率高，生长周期短，能够实现大规模工业化生产的特点[1-2]。HPLC-MS指纹图谱分析发现，固体培养铁皮石斛原球茎的主要化学成分与药材的基本相同，但相同成分之间的含量差别较大[3]。药理学研究表明，铁皮石斛原球茎与铁皮石斛药材均具有提高机体免疫功能的作用，且二者的作用强度相似[4]；铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1具有抗肿瘤和抗氧化作用[5-6]。这些研究结果显示了铁皮石斛原球茎替代或部分替代原植物成为一种新资源的潜力。

液体悬浮培养铁皮石斛原球茎的小分子化学成分已有报道[7]。本文报道了固体培养铁皮石斛原球茎化学成分的研究，从中分离鉴定了8个化合物，分别为：3-羟基-24-亚甲基-环羊毛脂烷(1)，3，5-二羟基-24-甲基-环羊毛脂烷(2)，3，5-二羟基-环羊毛脂烷(3)，β-谷甾醇(4)，豆甾醇(5)，N-阿魏酰基酪胺(6)，反式对羟基桂皮酸(7)和阿魏酸(8)。除β-谷甾醇外，以上化学成分均与液体培养原球茎的成分不同，其中化合物1,2,3和6为首次从石斛属植物中分离得到。

1 材料与仪器

固体培养铁皮石斛原球茎，培养基组成为：MS培养基大量元素减半，土豆200 g·L-1，煮20 min，取汁，蔗糖30 g·L-1，肌醇100 mg·L-1，pH 5.8，琼脂粉7.5 g·L-1。培养条件为温度24～26 ℃，光照强度1500 Lx，光照时间10 h·d-1。原球茎培养18周后收获，去除培养基，于50～55 ℃干燥后使用。

熔点由X-4型显微熔点仪测定(温度计未校正)；IR由Perkin-Elmer 983G 型红外光谱仪测定；MS由VG ZAB-2F型质谱仪测定；NMR由Bruker AM-500型核磁共振仪测定，TMS为内标。柱色谱用硅胶(100～200目、200～300目)、硅胶H，薄层色谱用硅胶G、GF254，均为青岛海洋化工厂产品。提取分离用试剂均为分析纯。

2 提取与分离

取铁皮石斛原球茎干燥材料800 g，甲醇回流提取3次，浓缩提取液，得到提取浸膏350 g。提取浸膏以蒸馏水分散，分别以石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各部分萃取浸膏65，15，36 g。取石油醚萃取浸膏10 g，以硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮(10∶1)洗脱部分共得到31个组分(Fr.1～Fr.31)。组分Fr.14经过硅胶柱色谱，石油醚-三氯甲烷(50∶1)洗脱，得到化合物1(600 mg)、2(15 mg)和3(10 mg)。组分Fr.25经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脱，得到化合物4(75 mg)和5(67 mg)。乙酸乙酯萃取浸膏经过硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱；三氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱部分再经过硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇-水(20∶1∶0.02)洗脱，共得到28个组分(Fr.1～Fr.28)。组分Fr.1～12合并后经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，得到化合物8(8 mg)；组分Fr.17～22合并后经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，得到化合物6(100 mg)和7(15 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色针簇状结晶(甲醇)，mp 121～122 ℃。Liebermann-Burchard反应阳性。EI-MSm/z：440[M]+，425，422，407，397，379，315，297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.33(1H，d，J=3.5 Hz，19-Ha)，0.56(1H，d，J=3.5 Hz，19-Hb)，0.81(3H，s，29-CH3)，0.90(3H，s，30-CH3)，0.89(3H，d，J=4.5 Hz，21-CH3)，0.97(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.02(3H，d，J=6.5 Hz，27-CH3)，1.03(3H，d，J=7.0 Hz，26-CH3)，3.28(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)，4.66(1H，s，31-Hb)，4.71(1H，s，31-Ha)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：156.9(C-24)，105.9(C-31)，78.8(C-3)，52.3(C-17)，48.8(C-14)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.5(C-4)，36.1(C-20)，35.6(C-12)，33.8(C-25)，32.9(C-15)，32.0(C-1)，31.3(C-23)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，28.3(C-21)，28.1(C-7)，26.5(C-16)，26.04(C-10)，26.00(C-11)，25.4(C-28)，22.0(C-27)，21.9(C-26)，21.12(C-22)，21.11(C-6)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.0(C-18)，14.0(C-29)。以上谱学数据与文献报道基本一致[8]，鉴定为3-羟基-24-亚甲基-环羊毛脂烷(cyclolanostane-3-ol,24-methylene)。

化合物2：白色针状结晶(甲醇)，mp 176～177 ℃。Liebermann-Burchard反应阳性。EI-MSm/z：458[M]+，443，440，425，422，407，397，379，353，318，315，和297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.32(1H，d，J=4.0 Hz，19-Ha)，0.54(1H，d，J=4.0 Hz，19-Hb)，0.80(3H，s，29-CH3)，0.87(3H，d，J=5.0 Hz，21-CH3)，0.89(6H，s，27-CH3，30-CH3)，0.91(3H，d，J=7.0 Hz，31-CH3)，0.96(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.07(3H，s，26-CH3)，3.28(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：78.8(C-3)，74.8(C-25)，52.2(C-17)，48.8(C-14)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.7(C-4)，36.54(C-24)，36.50(C-20)，35.5(C-12)，32.9(C-15)，31.9(C-1)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，29.4(C-23)，28.1(C-7)，26.4(C-16)，26.05(C-10)，26.01(C-11)，25.4(C-28)，23.4(C-26)，21.12(C-6)，21.10(C-22)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.4(C-21)，18.0(C-18)，17.5(C-27)，16.9(C-31)，14.0(C-29)。以上谱学数据与文献报道基本一致[8]，鉴定为3，25-二羟基-24-甲基-环羊毛脂烷(cyclolanostane-3,25-diol,24-methyl)。

化合物3：白色针状结晶(甲醇)，mp 183～184 ℃。Liebermann-Burchard反应阳性。EI-MSm/z：444[M]+，426，411，408，393，315，297。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.36(1H，d，J=4.0 Hz，19-Ha)，0.58(1H，d，J=4.0 Hz，19-Hb)，0.80(3H，s，29-CH3)，0.88(3H，d，J=6.5 Hz，21-CH3)，0.91(3H，s，30-CH3)，0.96(6H，s，18-CH3，28-CH3)，1.21(6H，s，26-CH3，27-CH3)，3.30(1H，dd，J=11，4.5 Hz，3-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：78.8(C-3)，71.1(C-25)，52.4(C-17)，48.8(C-14)，48.4(C-24)，48.0(C-8)，47.1(C-5)，45.3(C-13)，40.5(C-4)，36.1(C-20)，35.6(C-12)，32.9(C-15)，32.0(C-1)，30.4(C-2)，29.9(C-19)，29.3(C-27)，29.2(C-26)，28.2(C-7)，26.7(C-23)，26.5(C-16)，26.03(C-10)，26.00(C-11)，25.4(C-28)，21.12(C-6)，21.10(C-22)，20.0(C-9)，19.3(C-30)，18.3(C-21)，18.0(C-18)，14.0(C-29)。以上谱学数据与文献报道基本一致[8-9]，鉴定为3，25-二羟基-环羊毛脂烷(cyclolanostane-3,25-diol)。

化合物4：白色针状结晶(甲醇)，mp 136～137 ℃。EI-MSm/z：414[M]+，399，396，329，273，255。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.55(1H，m)，5.37(1H，d，J=4.7 Hz)。以上谱学数据与文献基本一致[10]，鉴定为β-谷甾醇。

化合物5：白色针状结晶(丙酮)，mp.165～167°C。EI-MSm/z：412[M]+，397，394，369，351，271，255。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.55(1H，m)，5.17(1H，dd，J=15.1，8.64 Hz),5.04(1H，dd，J=15.1，8.71 Hz)。以上谱学数据与文献报道基本一致[11]，鉴定为豆甾醇。

化合物6：白色无定型粉末(甲醇)。EI-MSm/z：313[M]+，193，192，178，177，145，120，107。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.94(3H，s，OCH3)，6.19(1H，d，J=15.5 Hz，7-H)，6.83(2H，d，J=8.4 Hz，3′-H，5′-H)，6.92(1H，d，J=8.3 Hz，5-H)，7.00(1H，d，J=1.5 Hz，2-H)，7.07(1H，dd，J=8.3，1.5 Hz，6-H)，7.11(2H，d，J=8.4 Hz，2′-H，6′-H)，7.56(1H，d，J=15.5 Hz，8-H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.74(7′-C)，40.91(8′-C)，55.91(OCH3)，109.53(6-C)，114.65(2-C)，115.52(2′-C，6′-C)，118.02(5-C)，122.15(7-C)，127.29(1′-C)，129.92(3′-C，5′-C)，130.80(1-C)，141.18(8-C)，146.63(3-C)，147.34(4-C)，154.34(4′-C)，166.19(C=O)。以上谱学数据与文献报道基本一致[12]，鉴定为N-阿魏酰基酪胺(N-feruloyltyramine)。

化合物7：白色针状结晶(丙酮)，mp 211～213 ℃。EI-MSm/z：164[M]+，147，119，91，65。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，d，J=15.5 Hz，8-H)，6.80(2H，d，J=8.5 Hz，3-H，5-H)，7.44(2H，d，J=8.5 Hz，2-H，6-H)，7.59(1H，d，J=15.5 Hz，7-H)。以上谱学数据与文献报道基本一致[13]，鉴定为反式对羟基桂皮酸(trans-p-hydroxycinnamic acid)。

化合物8：白色粉末，mp 169～170 ℃。TLC溴酚兰显色为黄色斑点。EI-MSm/z：194[M]+，179，150，135，107。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.97(3H，s，-OCH3)，6.33(1H，d，J=15.9 Hz，8-H)，6.96(1H，d，J=8.2 Hz，5-H)，7.09(1H，d，J=1.7 Hz，2-H)，7.13(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，6-H)，7.74(1H，d，J=15.8 Hz，7-H)。以上谱学数据与文献报道基本一致[14]，鉴定为阿魏酸(ferulic acid)。

[1] 张铭,朱峰,魏小勇,等.铁皮石斛种胚萌发和原球茎质量控制[J].浙江大学学报(理学版),2000,27(1)：92-94.

[2] 孟志霞,王春兰,陈晓梅,等.铁皮石斛原球茎/类原球茎的研究与应用[J].中国药学杂志,2013,48(19)：1620-1624.

[3] 陈晓梅,肖盛元,王春兰,等.真菌诱导子处理的铁皮石斛原球茎HPLC-MS指纹图谱分析[J].中国药学杂志,2008,43(24)：1859-1862.

[4] 高建平,金若敏,吴耀平,等.铁皮石斛原球茎与原药材免疫调节作用的比较研究[J].中药材,2002,25(7)：487-489.

[5] 何铁光,杨丽涛,李杨瑞,等.铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1对氧自由基和脂质过氧化的影响[J].天然产物研究与开发,2007,19(3)：410-414.

[6] 何铁光,杨丽涛,李杨瑞,等.铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1的理化性质及抗肿瘤活性[J].天然产物研究与开发,2007,19(4)：578-583.

[7] 孟志霞,舒莹,王春兰,等.铁皮石斛原球茎的化学成分研究[J].中国药学杂志,2012,47(12)：953-955.

[8] Pascual Teresa De,J G Urones,I S Marcos,et al.Triterpenes formEuphorbiabroteri[J].Phytochemistry,1987,26(6)：1767-1776.

[9] V Anjaneyulu,K Ravi,K Harischandra Prasad,et al.Triterpenoids formMangiferaindica[J].Phytochemistry,1989,28(5)：1471-1477.

[10] 马忠武,何关福,印万芬.中国特有种子植物白豆杉主要化学成分的研究[J].植物学报,1982,26(6)：553-556.

[11] 鄢元和,张长弓,宁嘉赓,等.恩施巴戟化学成分的研究[J].同济医科大学学报,1989,18(3)：201-202.

[12] Atta-ur-Rahman,M Khalid Bhatti,Farzana Akhtar,et al.Alkaloids ofFumariaindica[J].Phytochemistry,1992,31(8)：2869-2872.

[13] 赵晓宏,陈迪华,斯建勇,等.中药升麻酚酸类化学成分的研究[J].药学学报,2002,37(7)：535-538.

[14] LU Xin-hua,ZHANG Jin-juan,LIANG Hong,et al.Chemical Constituents of Angelica sinensis [J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2004,13(1)：1-3.

StudiesontheChemicalConstituentsofSolidCulturedDendrobiumofficinaleProtocorms

CHENXiaomei,YANGJunshan,GUOShunxing*,MENGZhixia

(InstituteofMedicinalPlantsDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)

Objective：To study the chemical constituents of solid culturedDendrobiumofficinaleprotocorms.MethodsThe chemical constituents were isolated using silica gel,Sephadex LH-20 column chromatography.ResultsEight compounds have been isolated form methanol extract of induced protocorms,and were identified as cyclolanostane-3-ol,24-methylene(1),cyclolanostane-3,25-diol-24-methyl(2),cyclolanostane-3,25-diol(3),β-sitosterol(4),stigmasterol(5),N-feruloyltyramine(6),trans-p-hydroxycinnamic acid(7)and ferulic acid(8).ConclusionCompounds1,2,3and6were isolated fromDendrobiumfor the first time.

Dendrobiumofficinaleprotocorms,Solid culture,Chemical constituents

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.001

2013-11-18)