珊瑚树Vibsane型二萜类化合物对人体HepG2细胞增殖的影响及其机制*

张海芳，王 林，刘 洁，周文斌，张刘珍，善亚君，余祖胤，刘 萍，唐红卫，从玉文△

（1.徐州医学院，江苏 徐州221002；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850；3.北京武警总医院，北京100390；4.解放军总医院海南分院药剂科，海南三亚572013）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma）是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、致死率高［1］。目前，早期肝癌的主要治疗手段仍是手术切除和肝脏移植。但由于肝癌起病隐匿、缺乏早期症状体征，超过70%的患者在确诊时已失去手术治疗的机会，只能采取非手术的保守疗法［2］。全身化疗是保守疗法的重要手段之一，但现有的化疗药物对肿瘤细胞的特异性不强、引起的毒副反应较大且易发生肿瘤耐药。因此，寻找治疗肝癌的新药是目前亟待解决的问题。

珊瑚树（viburnum odoratissimum）是忍冬科（caprifoliaceae）荚艹迷属植物，始载于《中国高等植物图鉴》，它的枝叶可入药，有通经活络功效，主治风湿痹痛、跌打肿痛、骨折。珊瑚树中主要含有二萜、三萜、黄酮、倍半萜、木脂素及香豆素苷等类化合物［3］。其中vibsanin型二萜类化合物是珊瑚树的特征化合物［4］。该类化合物分为3种亚型结构即十一元环型、七元环型和重排型，主要具有细胞毒、抗菌、鱼毒、抑制植物生长等活性，其中细胞毒活性报道较多。然而，有关此类化合物的抗肿瘤活性报道十分零散不系统，且缺乏相关作用机制的深入研究［5-10］。本实验室从云南珊瑚树（viburnum odoratissimum Ker-Gal.var.sessiliflorum）的叶子中分离提取得到多种十一元环二萜类化合物，研究其中的1＃、2＃3、8＃、10＃、12＃5种二萜化合物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

珊瑚树化合物，化合物储存液用DMSO配制，使用时用培养液稀释；RPMI-1640培养液，美国 Gibico公司；胎牛血，中国杭州四季青公司；RNA酶，美国Sigma公司；噻唑蓝 ，Thermo公司；台盼蓝，美国 Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒，北京宝赛生物技术有限公司；Apo-ONE Homogeneous Caspase-3／7试剂盒，美国Promega公司

1.2 仪器

FACSCalibur流式细胞仪，美国Becton Dickinson；DNM-9602G型酶标仪，北京普朗新技术有限公司；CO2培养箱，日本三洋公司；便携式化学发光检测仪，美国Perkin Elmer公司。

1.3 细胞株与细胞培养

人白血病 K562、人肝癌 HepG2和人食道癌EC109细胞株为本实验室冻存；K562、HepG2和EC109细胞株以 2×105cells／ml的密度种植在 50 mm2的培养瓶中，用含体积分数10%牛血清RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。

1.4 MTT法检测细胞增殖

测5种化合物对HepG2细胞增殖的影响：空白对照组：加入100μl DMSO；对照组：HepG2细胞＋含血清的RPMI1640培养液，共100μl；实验组：共设10个浓度组。HepG2细胞＋化合物1＃、2＃3、8＃、10＃、12＃（使其终浓度分别为 0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100μmol／l）共 100μl。

测化合物1＃对不同肿瘤细胞增殖的影响：空白对照组：加入 100μl DMSO；对照组：HepG2、EC109、K562细胞＋含血清的RPMI 1640培养液，共100μl；实验组：共设 10个浓度组。HepG2、EC109、K562细胞＋化合物1＃（使其终浓度分别为 0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100μmol／L）共 100 μl。取对数生长期的细胞，以 1.0×105cells／ml的密度接种于96孔培养板中，将96孔培养板放入37°C、5%CO2培养箱培养24 h，更换培养液，取二萜类化合物储存液，实验组加入二萜类化合物，用RPMI 1640培养液稀释至终浓度。每个浓度设3个复孔，放入细胞培养箱培养48 h。每孔加入20μl MTT溶液，37°C、5%CO2培养箱中继续孵育 4 h后，微量枪汲取上清弃去后，每孔加200μl DMSO溶液，在振荡器轻轻振荡15min，沉淀物溶解，MTT法检测珊瑚树化学成分对三种肿瘤细胞增殖影响，酶标仪上于波长570 nm处读取吸光值，绘制剂量效应曲线，求出珊瑚化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）。

1.5 细胞台盼蓝计数法

对照组：HepG2细胞（密度为 0.5×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培养液，共2 ml；实验组：共设5个浓度组。HepG2细胞（密度为0.5×105cells／ml）＋ 化合物 1＃（终浓度分别为 2.5、5、7.5、10 μmol／L），共 2 ml。取对数生长期的肝癌 HepG2细胞，种于6孔培养板，2 ml每孔细胞悬液，将6孔培养板在37°C、5%CO2培养箱培养 24 h，换培养液，取化合物1＃储存液，实验组加入化合物1＃，用RPMI 1640培养液稀释至终浓度。在培养箱继续培养12 h，24 h，36 h，48 h，用胰蛋白酶消化离心收集所有的细胞，台盼蓝染色，倒置显微镜下观察和计数，并记录结果。实验重复3次。。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期变化

空白对照组；2 ml DMSO溶液；对照组：HepG2细胞（密度为1×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培养液，共2 ml；实验组：共设5个浓度组。HepG2细胞（密度为1×105cells／ml）＋不同浓度的化合物1＃（终浓度分别为 2.5、5、7.5、10μmol／l），共 2 ml。取对数生长期的肝癌HepG2细胞，种于6孔培养板，2ml每孔细胞悬液。将6孔培养板在37°C、5%CO2培养箱培养24 h，换培养液，取化合物1＃储存液，实验组加入化合物1＃，用RPMI1640培养液稀释至终浓度。在培养箱继续培养12 h，24 h，，离心收集单细胞悬液（500×g，5 min），体积分数为70%的冰乙醇固定4℃过夜，固定后的细胞离心，弃上清，100 μl（1 mg／ml）RNase A酶，37℃处理 30 min，PI（100 μg／ml）染色后，流式细胞仪上机检测，实验重复 3次。

1.7 AnnexinⅤ／PI双标方法检测细胞凋亡

空白对照组；2 ml DMSO溶液；对照组：HepG2细胞（密度为1×105cells／ml）＋含血清的RPMI 1640培养液，共2 ml；实验组：共设5个浓度组。HepG2细胞（密度为1×105cells／ml）＋不同浓度的化合物1＃（终浓度分别为 5、7.5、10μmol／l），共 2ml。取对数生长期细胞，按1×105cells／ml的细胞密度接种于 6孔板在37°C、5%CO2培养箱培养 24 h，换培养液，取化合物1＃储存液，实验组加入化合物1＃，用RPMI1640培养液稀释至终浓度。在培养箱继续培养24 h，离心收集单细胞悬液（500×g，5min），用PBS洗涤1次，每个样品中加入100μl膜连蛋白Ⅴ（Annexin-Ⅴ），室温孵育 15min，然后加入 400μl PI（50 μg／ml）流式细胞仪检测，实验重复3次。

1.8 caspase-3／7活性检测

实验分为3组：空白对照组：Caspase 3／7试剂＋细胞培养液；阴性对照组 ：Caspase-3／7试剂＋不经处理的 HepG2细胞（密度为 1×105cells／ml）；实验组：Caspase 3／7试剂＋化合物＃处理的细胞。caspase 3／7活性检测按Apo-ONE Homogeneous Caspase-3／7试剂盒说明书进行。细胞经化合物1＃处理后24 h，加入50μl含 Z-DEVD-罗丹明110的 Caspase-3／7缓冲液（Promega）培养板置室温避光反应30 min，用微孔板荧光检测仪测定在激发光波长485 nm，发射光波长535 nm处的荧光值。实验重复3次。

1.9 统计学分析

实验数据采用均值±标准差（¯x±s）表示，统计分析采用 SPSS 16.0软件进行单因素多水平方差分析。

2 结果

2.1 化合物对HepG2细胞增殖的影响

为了测定vibsane型二萜类化合物对人肝癌细胞增殖的影响，HepG2细胞经各化合物处理48 h，MTT检测细胞活性，结果显示HepG2，细胞增殖均受到明显抑制，其中化合物1＃对HepG2细胞的增殖抑制作用最显著，IC50值为 5.86±1.85μmol／l；化合物2＃3和 8＃活性次之，IC50值分别 7.34±2.07 μmol／L、7.54±0.99μmol／L，化合物 10＃和 12＃抑制HepG2细胞增殖的作用则相对较弱，其IC50值分别为 18.15±2.49μmol／L和 15.94±3.63μmol／L。这五种化合物对HepG2细胞的增殖抑制作用差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。为了发现此类二萜化合物的结构活性基团，我们以其IC50值为指针，进行初步的构效关系分析。结果显示，化合物C-14位（10＃化合物）和 C-15位（12＃化合物）分别连接-OH，活性显著降低，而 C-15位连接-OOH（8＃化合物）对活性影响较弱。此外，在C-6、C-7位形成环氧基（2＃3化合物）也减弱化合物活性。结果提示该类化合物十一元环C11位连接侧链的基团修饰对化合物抑制肿瘤细胞增殖活性影响较大。

Fig.1 The antiproliferative effect of the chemical composition on HepG2 cells

2.2 1＃化合物对不同肿瘤系细胞增殖的影响

为了进一步观察不同组织来源的肿瘤细胞对化合物1＃的敏感性，将化合物1＃分别处理人肝癌HepG2、人白血病K562和人食道癌 EC109细胞，结果表明，化合物1＃对上述三种肿瘤细胞系的增殖均有不同程度的抑制作用，其 IC50分别为5.86±1.85μmol／L、8.68±1.29μmol／L、26.94±0.31μmol／L，其中 HepG2细胞对化合物1＃最为敏感（P＜0.01）。

鉴于上述MTT实验结果，选择化合物1＃作为后续的研究对象。

2.3 1＃化合物抑制HepG2细胞增殖的剂量效应和时间效应

如表1所示，随着化合物＃作用浓度的增加和处理时间的延长，细胞增殖受到明显抑制，较高浓度（7.5μmol／L、10μmol／L）化合物处理后的 HepG2细胞48 h内几乎没有增殖，化合物1＃抑制HepG2细胞增殖具有显著的时间（P＜0.05）和剂量依赖性（P＜0.01）。

Tab.1 Compound 1＃inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose and time dependentmanner（%，¯x±s，n＝3）

2.4 1＃化合物对HepG2细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期的结果显示，不同浓度（2.5～7.5μmol／L）的化合物 1＃作用于 HepG2细胞12 h后，化合物1＃引起HepG2细胞G0／G1期细胞比例剂量依赖性增加，S期细胞比例剂量依赖性减少。2.5μmol／L化合物 1＃作用 HepG2细胞 12 h对细胞周期无影响，5、7.5μmol／L 1＃化合物作用HepG2细胞12 h，G0／G1期细胞比例明显高于对照组（P＜0.05），S期细胞比例明显减少（P＜0.05），G2／M期细胞比例则改变不明显。2.5～7.5μmol／L化合物1＃作用HepG2细胞24 h，G0／G1期细胞比例明显高于对照组（P＜0.05），S期细胞比例明显减少（P＜0.05），G2／M期细胞比例则改变不明显。这些结果显示化合物1＃诱导HepG2细胞发生显著的G0／G1期周期阻滞（表 2）。

Tab.2 Effect of the compound 1＃on HepG2 cells cycle（%，¯x±s，n＝3）

2.5 1＃化合物诱导 HepG2细胞凋亡

用AnnexinⅤ／PI双标方法分析1＃化合物对HepG2细胞凋亡的影响，结果显示1＃化合物（5～10 μmol／L）孵育细胞24 h，细胞凋亡率随着1＃化合物的浓度增高而增加，与对照组相比，细胞凋亡率有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。表明 1＃化合物可显著诱导 HepG2肿瘤细胞发生凋亡（图2，表3）。

Fig.2 The compound 1＃induced HepG2 cells apoptosis

Tab.3 The compound 1＃induced HepG2 cells apoptosis（%，¯x±s，n＝3）

2.6 1＃化合物对HepG2细胞Caspase-3酶活性的影响

Apo-ONE HomogeneousCaspase-3／7试剂盒检测caspase3／7活性变化结果显示：化合物 1＃处理HepG2细胞24 h，随着化合物浓度的增高，Caspase-3酶活性逐渐增强，较高浓度（5～10μmpl／L）化合物诱导Caspase-3／7活性明显升高（与对照相比，P＜0.05，P＜0.01，表 4）。结果表明 1＃化合物诱导剂量依赖性Caspase-3／7激活。

Tab.4 Activity assay Caspase 3 activation（%，¯x±s，n＝3）

3 讨论

目前，对于不能手术治疗的晚期肝癌，其中全身化疗是其治疗的重要手段之一。但是大多数化疗药都因选择性差，毒副作用大而且容易产生耐药性，因此，寻找高效、低毒、选择性强的天然抗肿瘤药物很有必要。本研究首次报道珊瑚树特有的vibsane型二萜类化合物对人肝癌细胞具有显著的增殖抑制作用，并对其机制进行了初步研究，结果表明化合物1＃抑制肿瘤作用最强，且对HepG2细胞最为敏感，因此选择化合物1＃为后续的研究对象；化合物1＃能通过诱导细胞周期G0／G1期阻滞和细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞生长。研究发现多个vibsane型二萜类化合物均有抗肿瘤活性，抑制构效关系分析表明十一元环C11位连接侧链的基团修饰对化合物活性有明显影响。由于筛选的化合物有限，我们对此类化合物发挥抗肿瘤作用的关键基团依然知之甚少，尚需进一步对其结构修饰后评价其构效关系。

细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，体内各种细胞自主有序性的死亡。细胞凋亡调控失调导致的细胞凋亡抵抗（resistance to apoptosis）是肿瘤发生的主要原因之一［11，12］。而诱导细胞凋亡是抗肿瘤的主要机制之一，多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［13］。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗肿瘤药物的新靶点。本文研究发现较低浓度的1＃化合物显著诱导HepG2细胞周期 G0／G1期阻滞，随着药物浓度提高，则细胞凋亡明显增加，表现为磷脂酰丝氨酸外翻以及Caspase3／7激活。Caspase可分为两类：始动Caspases和效应Caspases，前者包括 caspase-2，-8，-9及-10，后者包括 caspase-3，-6及-7［14］。与 Caspase相关的凋亡调节路径主要有两个：一是细胞表面死亡受体途径，另一个是线粒体途径［15］。本研究发现1＃化合物显著激活 Caspase3／7，提示其可能激活Caspase通路参与其诱导的细胞凋亡，但化合物激活何种caspase凋亡途径仍未可知，其是否诱导caspase依赖的细胞凋亡也有待进一步研究。我们在上述实验结果的基础上，正深入研究vibsane型二萜类化合物如何影响细胞周期和启动细胞凋亡信号转导机制，及其对细胞周期相关蛋白激酶活性和细胞凋亡相关基因表达的影响。

珊瑚树中的vibsanin型二萜类化合物在自然界植物中分布非常有限，但其结构又是复杂多样的，且活性特点各异、强弱不一，因此对vibsanin型二萜类化合物进行系统的分离纯化、活性筛选及构效关系分析，并对其可能的抗肿瘤作用及其机制进行深入研究，有望为研发新型天然植物类抗肿瘤药物提供实验依据。

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