星点设计-响应面法优化闹羊花中二萜的提取工艺△

孙婧，吴建华，宋艺君，戴洋

陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046

闹羊花RhododendronmolleG.Don是著名有毒的杜鹃花属植物[1]，其毒性成分主要包括梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素等二萜类化合物[2-3]。近代研究表明，二萜类化合物在抗肿瘤、抗菌、抗病毒等方面具有重要的医用价值[4]。而目前主要的提取工艺为乙醇回流法[5]，但此法对样品处理时有一定的局限性，如效率低下、受热时间长、活性组分易被破坏等[6]。

随着超声技术的不断发展，超声波提取工艺由于成本低、效率高、周期短等优势[7]，在药物、食品等学科门类中应用广泛[8-9]。针对超声波提取二萜类物质文献报道甚少，因此本文采用该法提取闹羊花中总二萜物质，并结合星点设计法[10]对其工艺进行了优化，得到了最佳的工艺条件。这既可作为提取闹羊花中同类物质的参照，又可为扩大实际生产提供一定的技术支持和参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HP1100高效液相色谱仪(北京吉星达成科技有限公司)；KQ-50E型超声波清洗器(广州君达仪器仪表有限公司)；BP211D电子天平(德国Sartorius)；DZKW-4型电子恒温水浴锅(河南天帝电子科技有限公司)；FW200型高速万能粉碎机(北京成萌伟业科技有限公司)。

1.2 试药

对照品梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素由西北大学化工学院白乃生教授提供，纯度大于99%；水为双蒸水；乙醇；其余试剂均为分析纯。

闹羊花药材，购于河北省某医药原料市场，经白乃生教授鉴定为闹羊花RhododendronmolleG.Don的花。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

分别称取梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素对照品适量，然后加入60%(v%，下同)的乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，分别制成梫木毒素(质量浓度为1.926 mg·mL-1)、木藜芦毒素(质量浓度为2.202 mg·mL-1)、闹羊花素(质量浓度为2.173 mg·mL-1)的对照品混合溶液备用。

2.2 样品制备及提取实验

影响闹羊花二萜类化合物提取工艺的因素主要有溶剂种类、溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取次数。

理想且最为常用的溶剂种类包括甲醇、乙醇、丙酮等。而甲醇和丙酮有一定的毒性，因此选择乙醇作为提取闹羊花二萜类物质的溶剂，并结合相关研究[11]选择了60%的乙醇溶液。

将闹羊花用粉碎机打碎后过40目筛，精密称取粉末0.5 g，置于带塞的锥形瓶中，加入60%乙醇25 mL。因提取次数为非连续变量，结合实际工业化生产，固定为2次[12]。在常规乙醇回流法和乙醇超声法两种工艺下各提取30 min，通过3组不同工艺的对比实验确定最佳的提取方法，结果见表1。然后设置不同的料液比、提取温度和提取时间进行单因素试验。最后经0.45 μm微孔膜过滤后取1 mL溶液，用60%乙醇定容于10 mL容量瓶中备用。

表1 不同提取方法对二萜提取量的影响 mg·g-1

由表1可知，采用常规乙醇回流法所得的闹羊花中二萜提取量低于乙醇超声工艺所得。这是因为超声波是一种弹性波，振动产生较大的能量，有助于乙醇和二萜物质的传质过程，最终增加了二萜的提取量[13]。因此选用乙醇超声法作为最佳的提取工艺。

2.3 标准曲线绘制

采用液相色谱法得到了测定梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素含量的回归方程，分别为Y1=37.14X1-2.18，r=0.999 9；Y2=62.39X2-4.26，r=0.999 8；Y3=56.82X3+1.35，r=0.999 9。拟合的相关系数r值均较高，可用于后续的分析测定。

2.4 精密度试验

取对照品溶液于1 d内连续进样5次，计算梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素的峰面积，计算RSD(n=5)分别为1.64%、1.17%、0.59%。

2.5 重复性试验

精密称取闹羊花粉末5份，制备样品溶液，测定峰面积，计算RSD(n=5)值分别为1.53%、1.15%、0.41%。

2.6 稳定性试验

取2.2.5的样品溶液，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，记录峰面积并计算RSD值为2.2%，表明供试样品在24 h内保持稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知总二萜类化合物含量的同一闹羊花粉末5份，每份0.5 g，各加入对照品溶液中含量相当的溶液，梫木毒素、木藜芦毒素和闹羊花素的对照品按2.1制备，结果测得平均回收率为104.83%(n=5)。

3 二萜类化合物收率及含量测定

3.1 二萜类化合物含量测定

取2.1所得滤液，测定二萜类化合物的含量。

3.2 二萜类化合物收率测定

将2.1滤液浓缩后真空干燥，得浸膏粉，然后按照式(1)计算含量。

(1)

式中：Y表示二萜类化合物含量；C为总二萜类化合物质量浓度；V为提取液体积；m为样品质量。

4 结果

4.1 单因素试验

4.1.1 料液比对二萜提取量的影响 固定提取温度为50 ℃，提取时间为40 min，研究不同料液比对二萜物质提取量的影响规律，结果见图1。

图1 料液比对二萜物质提取量的影响

由图1可知，提取的二萜物质提取量随溶剂乙醇用量的增大呈先增后减的趋势。当料液比为1∶40时，二萜物质的提取量达到最大。这是因为当乙醇用量较小时，二萜物质的提取量小，而乙醇用量过大时，提取出的二萜物质可能部分被溶解破坏，导致含量略有降低。

4.1.2 提取温度对二萜提取量的影响 固定料液比为1∶40，提取时间为40 min，研究不同提取温度对二萜物质提取量的影响规律，结果见图2。

图2 温度对二萜物质提取量的影响

由图2可知，二萜物质的提取量随温度的升高呈增大的趋势，但增加趋势逐渐减小。当提取温度为60 ℃时，二萜物质提取量为59 mg·g-1，而当温度为70 ℃时二萜提取量仅增加了0.5 mg·g-1。由此可以看出，当温度高于60 ℃时，继续增加温度，对于二萜物质提取量的增加并没有实质性作用，且当温度过高时，对于二萜类物质也会造成一定的影响，综合分析适宜的提取温度为60 ℃。

4.1.3 提取时间对二萜提取量的影响 固定料液比为1∶40，提取温度为60 ℃，研究不同的提取时间对二萜物质提取量的影响规律，结果见图3。

图3 时间对二萜物质提取量的影响

由图3可知，二萜物质的提取量随提取时间的增大呈先增后减的趋势。当提取时间为40 min时，二萜物质提取量达到最大值59 mg·g-1，此后随着时间的增加，二萜物质提取量逐渐减小，这可能是由于时间过长，溶出了更多的杂质，降低了二萜物质的提取量，这也与成英等[14]研究类似，因此适宜的提取时间为40 min。

4.2 星点设计优化工艺

为了得到最佳的闹羊花二萜类化合物提取工艺，采用星点设计-响应面优化法对其进一步优化，所用软件为Design-Expert8.0。以料液比X1、提取温度X2、提取时间X3为因素，以二萜提取量Y为响应值，设计三因素五水平试验方案。根据星点设计规则，任意两个物理量的差值与对应代码之间成等比的原则，水平编码分别取±1.68、±1和0，因素水平见表2。实验方案设计及结果见表3，实验方差分析见表4。

表2 星点设计各因素水平

表3 星点设计方案和结果

表4 方差分析表

由星点设计试验经响应面二次模型分析法得到了料液比X1、提取温度X2、提取时间X3对二萜提取量Y的回归方程：

Y=63.68+0.15X1+5.00X2+0.33X3+

0.40X1X2+0.47X1X3+0.27X2X3-

由表4可看出，所拟合的模型方程显著性小于0.000 1，说明上述回归方程极为显著。失拟误差均大于0.05，说明不存在失拟因素。所以完全可以利用此回归模型代替真实的实验点来进行数据的比对和分析，结果亦是合理和可靠的。一次项系数X2的显著性小于0.000 1，表现差异有统计学意义，但X1和X3的显著性大于0.01，表明对二萜提取量影响不显著，这是由于料液比和提取时间增大时，二萜类物质的提取量达到了极限，此时二萜物质几乎完全被提取出，因此相较于提取温度而言表现不显著。此外由F值和显著性的大小可知，对浸膏得率和二萜提取量影响因素的大小顺序均为：提取温度>提取时间>料液比。

根据实验结合星点设计结果，得到各因素间交互作用的三维空间曲面图和等高线图，见图4。

响应曲面的起伏高度显示了各因素对响应值的影响大小，其关系成正比。即曲面起伏高度越陡，该因素对响应值影响越明显。等高线密集成椭圆表示两因素交互作用大，而成圆形时表明交互作用小。所以通过图4的比较，对二萜提取量影响最大的因素是提取温度，最小的为料液比。这与上述方差分析表得出的结论也是一致的。

通过对各因素的优化，得到了最佳的闹羊花二萜类化合物提取工艺条件：料液比为1∶40.29，提取温度为63.15 ℃，提取时间为40.53 min。预测最大的闹羊花二萜提取量为65.27 mg·g-1。

4.3 可靠性验证

为了验证星点设计试验的可靠性，考虑到实际情况，微调了最佳工艺，进行3组验证试验，得到了闹羊花二萜提取量分别为63.92%、64.78%和62.85%，这与星点设计预测值的相对误差在5%以内，说明了星点设计试验方案可靠，结果较为准确。

5 结论

采用星点设计-响应面法对闹羊花中二萜物质的提取工艺进行了优化，得到了闹羊花二萜的最优提取工艺条件：料液比1∶40.29，提取温度63.15 ℃，提取时间40.53 min。预测最大的闹羊花二萜提取量为65.27 mg·g-1，并通过实验验证了星点设计方案的合理性与可靠性。所以该工艺条件既可为后期提取闹羊花中同类物质作参照，又可为扩大实际生产提供一定的技术支持和参考价值。

注：A.料液比和提取温度对二萜提取量的交互作用；B.料液比和提取时间对二萜提取量的交互作用；C.提取温度和提取时间对二萜提取量的交互作用。图4 各因素交互作用三维曲面图