药品细菌内毒素检查法实验体会

刘恩思

药品细菌内毒素检查法实验体会

刘恩思

鲎是海边栖生的一种大型节肢动物, 其多功能血细胞(变形细胞)的溶解物中含有一种可凝性蛋白质, 在极微量内毒素(0.0005 vg/ml)存在时可形成凝胶。鲎试验法是利用此原理测定血液或其他样品中的微量内毒素的生物体外检测技术。自从1964年美国学者发现鲎试验法以来, 因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点, 该法正被日益广泛地应用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。在20世纪70年代初期, 我国学者对鲎试验法开始了研究。1991年, 卫生部部版标准首次收载了细菌内毒素检查法；1993年,《中国药典》(1990年版)第二增补本正式收载该法, 《中国药典》(2000年版)增加了细菌内毒素检查法应用指导原则, 《中国药典》收载使用该法的品种逐版增加, 《中国药典》(2010年版)［1］增至416个品种。

细菌内毒素检查法灵敏度高, 受到许多因素的干扰。溶液pH值不适宜、二价阳离子不足、酶活性不足导致由内毒素激活的酶反应受抑制；内毒素标准品稀释不当、器具吸附、放置时间过长内毒素自身聚集, 温度、酸碱破坏引起的内毒素损耗都会出现假阴性结果。除内毒素外, β-葡聚糖也与鲎试剂发生反应, 生成凝胶, 出现假阳性结果。结合自己的工作体会, 总结了鲎试验中的几点注意事项。

1 鲎试剂

1.1鲎试剂灵敏度复核 《中国药典》规定每批鲎试剂在用于试验前应复核灵敏度。鲎试剂在生产、销售、运输、贮藏、使用等过程中, 易受到外界因素的影响, 如温度、光线、时间等, 使促凝活性降低。尤其是不同厂家或不同批号的产品不同生产厂家的鲎试剂, 即使标示灵敏度相同, 检测同一检品时, 也可能出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂造成的判断失误。

1.2美国药典要求应使用经特殊制备、不与β-葡聚糖反应的鲎试剂检测含葡聚糖的样品(如右旋糖酐20葡萄糖注射液、右旋糖酐40氯化钠注射液等)。我国药典没有类似规定, 在鲎试剂选择上要慎重。含葡聚糖的样品若出现阳性结果, 应高度重视, 使用抗增液复溶鲎试剂可排除这种干扰。

2 鲎试剂的正常反应需中性的pH值、一定浓度的钠离子和二价阳离子

2.1pH值 鲎试验的反应混合液pH值应在6~8范围内。用细菌内毒素检查用水在容许范围内稀释供试品。用酸、碱或缓冲液调节pH值。供试品稀释倍数太大、内毒素含量太低、鲎试剂灵敏度不够, 造成假阴性结果。试验前一定要计算最大有效稀释倍数。调节pH值使用强酸、强碱和pH剂。pH试纸准确度不够。弱酸、弱碱调节时用量较大, 可能引入较多的内毒素。

2.2样品中含有螯合剂时, 使用硫酸镁缓冲剂稀释样品可维持二价阳离子浓度。

2.3加热或超滤可除去蛋白和酶的影响。

2.4实验器具 实验器具应充分洗涤并冲洗干净, 特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后, 更应冲洗干净, 以免残留物破坏极微量的内毒素。避免使用对内毒素有吸附作用的实验器具, 所以最好是使用专用器具。

2.5在内毒素标准品配制和使用过程中, 经常使用漩涡混合器, 避免内毒素自身聚集。内毒素标准品溶液保存的温度、时间、浓度应经验证确认, 若使用频率低, 最好现配现用。

2.6试验用的试管架最好专门定制, 孔径应与安瓿或试管直径相接近, 避免左右晃动。保温过程中不可随时取出观察,防止试管受到振动后造成凝胶变形而误判为阴性。温度对鲎试剂的灵敏度影响很大, 随着温度的升高以及延长保温时间,鲎试剂的灵敏度亦增大, 增加假阳性。温度过高会破坏鲎试剂。应控制在(37±1)℃之间, 保温(60±2)min。细菌内毒素测定仪可以较好的满足以上条件。

2.7操作时应将手用酒精消毒, 安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿), 用手半拉半掰将颈部折断,千万不能用镊子敲击, 防止碎玻屑掉入安瓿。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时, 取样均应准确, 缓缓加入避免气泡。双手避免在安瓿或试管的上方来回移动, 加样后用封口膜迅速封闭管口, 操作要快, 否则易致假阳性的出现。

［1］ 国家药典委员会.中国药典(一部).北京：中国医药科技出版社, 2010.

2014-05-05］

625000 雅安市食品药品检验所