常规受精失败行早期补救ICSI中透明带结合精子的选择性应用（附2例报道及文献复习）

徐鸿毅 罗清炳 陈 娟 张 颖 张 鑫 张昌军

湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心（十堰 44200）

·短篇报道·

常规受精失败行早期补救ICSI中透明带结合精子的选择性应用（附2例报道及文献复习）

徐鸿毅 罗清炳 陈 娟 张 颖 张 鑫 张昌军*

湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心（十堰 44200）

自卵胞浆内单精子显微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）应用于辅助生殖技术获得成功妊娠以来，ICSI技术已经从单纯男性精子的因素推广到治疗免疫性因素、体外受精失败等因素导致的不孕。近年来,体外常规受精失败患者的卵母细胞由隔夜行补救ICSI逐步改进到短时补救，很多报道[1-3]已经证实通过短时受精判断受精与否, 再行补救 ICSI，获得了良好的妊娠结局。在此基础上我们对常规受精失败中行早期补救ICSI时选择卵母细胞透明带（zona pellucida, ZP）上黏附的精子行ICSI，现报道2例如下。

临床资料

一、病例1

患者，女，35岁，月经规律，结婚9年未避孕未孕，2012年3月来我院就诊， 输卵管造影检查双侧输卵管梗阻，B超检测示卵泡发育不良，男方精液检查诊断为轻度弱精子症。夫妇染色体检查正常。标准长方案黄体期降调节超促排卵,于前一月经周期黄体中期D23应用曲普瑞林（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）（德国辉凌公司生产，3.75mg/支）0.1mg皮下注射，月经第11天同时开始给予促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）（瑞士雪兰诺公司生产，75 IU/支）225 IU/ 支×12d，停用FSH当日，A 型子宫内膜，厚度为10.3mm，卵泡直径大于18 mm（5个），人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）（珠海丽珠公司生产，5 000 IU/支） 注射5 000～1 000 IU，取卵日男方精液检查：密度为82×106条精子/mL，精子活动率为68%： a级12%，b级26%，c级30%，d级32%；患者手术获卵10只，卵冠丘分散度适中，常规授精，加精密度调整为每个卵子周围约10～15万条精子，加精5h后拆除卵周颗粒细胞观察8枚MII期卵母细胞第二极体均未排出，1枚为MI期卵子，半小时后观察成熟卵子仍未变化，即行补救ICSI，ICSI时选取成熟卵母细胞上黏附精子，16 h后观察原核，形成7个2PN，继续培养后获胚胎7枚，根据Ziebe等[4]进行胚胎形态学评分，Ⅰ级胚胎2枚，Ⅱ级胚胎1枚，Ⅲ级胚胎1枚，Ⅳ级胚胎3枚，移植两枚Ⅰ级胚胎，余3枚行玻璃化冷冻。移植后14 d 验尿 hCG 为阳性，移植4周后B超显示见宫内单胎妊娠,监测中胎心正常，目前已分娩 1个正常女婴。

二、病例2

患者，女，25 岁，结婚4年未避孕未孕，月经规律。2010年在外院检查输卵管造影检查双侧输卵管粘连，行双侧输卵管疏通术，仍未孕，于2013年5月来我中心行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗，输卵管造影显示输卵管通畅，盆腔粘连，B超检测排卵正常，男方精液检查诊断为中度弱精子症，夫妇染色体检查正常。标准长方案黄体期降调节超促排卵，于前一月经周期黄体中期D23应用GnRH-a，0.1mg皮下注射，月经第5天同时开始给予FSH 125 IU/ 支×9d，停用促性腺激素（Gn）当日，子宫内膜显示不均，平均厚度为16mm，卵泡直径大于 18 mm（4个），hCG 注射1 000 IU，取卵当天男方精液检查密度4 ×106条精子/mL，精子活动率为53%： a级0%，b级23 %，c级30 %，d级47 %；获卵14只，卵冠丘分散度适中，常规授精，加精密度调整为每个卵子周围约10～15 万条精子，加精5.5h后拆除卵周颗粒细胞观察11枚MⅡ期卵母细胞第二极体均未排出，3枚未成熟，观察每个未成熟卵母细胞透明带黏附有5～10条精子，半小时后观察成熟卵母细胞极体仍未排除，即行补救ICSI，ICSI选取未成熟卵母细胞上黏附精子，14～16h观察原核情况，9枚为2PN，继续培养后获Ⅰ级胚胎2枚，Ⅱ级胚胎1枚，Ⅲ级胚胎3枚，Ⅳ级胚胎枚，移植两枚Ⅰ级胚胎，余4枚行囊胚培养，形成两枚囊胚评分均为4BB，囊胚行玻璃化冷冻。胚胎移植后14d 验尿 hCG 为阳性，移植后4周B超见宫内单孕囊，目前已分娩 1个 正常男婴。

讨 论

ICSI技术主要用于少、弱、畸形精子症造成的受精力低下、受精障碍以及梗阻性无精子症患者的辅助生殖治疗。辅助生殖技术的进一步发展，为我们提供了较理想的促排卵方案，足以使我们获得所需要的成熟卵母细胞，但在每个实验室几乎都不可避免的仍然发生一定比例的卵母细胞受精障碍现象，目前在常规受精过程中卵子受精失败发生率约 5%～15%[5]。对于受精障碍的卵母细胞我们采用补救性ICSI，从原来的18～20h缩短到6～8h[1-3,6]，这为防止卵母细胞提前老化赢得了时间，使有限的卵母细胞控制在受精窗内，取得了一定的效果。由于女性患者卵子数量有限，从体内取出后质量也无从改变，因此寻找潜在提高妊娠空间的方法应从选择精子的角度考虑。

在体外常规受精中精子数量达到一定的标准才能实施常规受精，加精后的精子数量远远高于因严重少精子症行ICSI的精子，在受精障碍补救ICSI中我们所使用的精子是由实验技术人员用当天常规授精后剩余的精子，从数千万精子中挑选理想的精子是比较困难的事情，并且用肉眼在低倍显微镜下人为主观地挑选，这样更难鉴别出精子有无缺陷，也失去了卵子与精子之间的自然选择。早在1997年Garrett等[7]观察到，在IVF治疗过程中, 通过对与ZP结合的精子形态进行检查,结果显示和卵细胞ZP结合精子比普通用于受精的精子在形态上更好。Black等[8]也认为精-卵透明带理想状态的结合对受精的完成十分重要, 凡是结合到透明带上的精子大部分都是形态正常的。另有报道不孕患者在直接行ICSI治疗时使用了未成熟卵ZP上穿越的精子行ICSI能取得较好的妊娠率[9]。

在受精障碍补行ICSI中，精子从优化到ICSI实施需要6～8h，研究报道精子过长时间孵育也会产生一些代谢产物，其中活性氧水平过高就会对精子产生脂质过氧化和DNA氧化损伤[10,11]，可能影响其获能、受精[12]，而培养液中活性氧增多也可以使胚胎碎片增多[13]，在传统受精障碍补行ICSI 使用的是剩余的、已在体外孵育过长时间的精子，部分精子死亡产生的代谢物也可能会对其他精子带来不利的影响。研究报道卵子颗粒细胞可以产生抗氧化物质[14]，在精卵混合液滴中的精子特别是结合在透明带上的精子周围还存在未剥离的颗粒细胞，在颗粒细胞的环境下可能会因抗氧化物质的作用使精子的氧化损伤更小，因此在受精障碍卵母细胞补救性ICSI时，使用透明带上结合的精子可能是一种理想的选择，本文2例中分别用成熟卵母细胞和未成熟卵母细胞结合的精子均获得了妊娠，可说明选择卵母细胞成熟度不影响透明带所黏附的精子质量。

由于这种方法在技术上较常规挑选精子耗时，且去除颗粒细胞后并非所有卵母细胞透明带上均黏附有精子，这需要技术人员的经验和操作手法，结局是否优于常规选择的精子还需要增加样本量证实。但根据文献和精子的自然选择结果，这种方法不失为早期补救性ICSI进一步改进提供了一种新的思路。

透明带; 精子; 精子注射, 细胞质内

1 孙海翔. 早期补ICSI的安全性和应用价值. 生殖医学杂志 2009; 18(3): 195-197

2 Nagy ZP, Rienzi LF, Ubaldi FM,et al.Effect of reduced oocyte aging on the outcome of rescue intracytoplasmic sperm injection.Ferti Steril2006; 85(4): 901-906

3 刘素英, 曹英, 曹翔, 等. 早期补救ICSI应用价值的初步探讨. 生殖与避孕 2010; 30(11): 742-744, 778

4 Ziebe S, Petersen K, Lindenberg S,et al. Embryo morphology or cleavage state:how to select the bes embryos for transfer after in vitro fertilization.Hum Reprod1997; 12(7):1545-1549

5 Mahutte NG, Arici A. Failed fertililization: is it predictable.Curr Opin Gynecol2003; 15(3): 211-218

6 严正杰, 蔡令波, 冯婷, 等. 对体外受精失败后不同授精时间进行补救ICSI的结局比较. 生殖与避孕 2009; 29(5): 329-332

7 Garrett C, Liu DY, Baker HW. Selectivity of the human sperm-zona pellucida binding process to sperm head morphometry.Fertil Steril1997; 67(2): 362-371

8 Black M, Liu De Y, Bourne H,et al. Comparison of outcomes of conventional intracytoplasmic sperm injection and intracytoplasmic sperm injection using sperm bound to the zona pellucida of immature oocytes.Fertil Steril2010; 93(2): 672-674

9 刘锋, 丘映, 邹彦, 等. 精子与卵母细胞透明带结合对ICSI治疗结局的影响. 生殖与避孕 2011; 31(1): 25-29

10 O WS, Chen H, Chow PH. Male genital tract antioxidant enzymes-their ability to preserve sperm DNA integrityMol Cell Endocrinol2006; 250(1-2): 80-83

11 Henkel RR, Schill WB. Sperm preparation for ART.Reprod Biol Endocrinol2003; 1(1): 108

12 Tsunoda S, Kawano N, Miyado K,et al. Impaired fertilizing ability of superoxide dismutase 1-deficient mouse sperm during in vitro fertilization.Biol Reprod2012; 87(5): 121

13 Lee TH, Lee MS, Liu CH,et al.The association between microenvironmental reactive oxygen species and embryo development in assisted reproduction technology cycles. Reprod Sci2012; 19(7): 725-732

14 Matos L, Stevenson D, Gomes F,et al. Superoxide Dismutase expression in human cumulus oophorus cells.Mol Hum Reprod2009; 15(7): 411-419

（2014-09-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.016

R 321-33

*通讯作者, E-mail: sycjzhang@sohu.com