精子氧化损伤机制和防护研究的新进展

孙忠凯郭凯敏综述 田润辉审校

1. 广东省梅州市第一人民医院泌尿外二科（梅州 514031）; 2

. 吉林大学第一医院男科; 3. 吉林大学第一医院心理卫生科

精子氧化损伤机制和防护研究的新进展

孙忠凯1郭凯敏2综述 田润辉3审校

不孕不育已经是困扰夫妻生活的社会难题，其中几乎一半是由于男方因素造成的。随着对男性生殖的不断研究以及精液冷冻技术的发展，人们的发现氧化损伤造成的精子功能和结构的改变往往对精子的质量产生影响，因此我们有必要了解氧化应激损伤的机制，寻找正确的途径和方法来减少或预防这些损伤，其中抗氧化剂的应用被普遍关注。本文综述精子氧化损伤的机制以及几种常见的抗氧化剂对精子体内外的影响，旨在为临床更好的将抗氧化剂应用于男性不育症以及提高精子冷冻复苏提供重要依据。

一、精子氧化损伤机制

正常情况下，男性生殖道中ROS的产生和清除之间存在一种平衡，只有在少量的活性氧（ROS）产生的情况下才会对精子正常的生理活动和功能起着重要的作用如获能、提高精子细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）水平、顶体反应以及精卵融合。而往往当男性生殖系统出现病理过程，如炎症、感染时则会导致精浆中多形核白细胞、未成熟精子ROS的大量的产生。此外，人精子在冷冻保存过程中，经历了降温、冻结等过程，其活力和受精率会低于新鲜精液，原因是精子在冷冻过程中受到了氧化损伤，产生过多的ROS，以至于造成精子膜、DNA和蛋白质的损伤

（一）精子膜损伤

目前众多研究表明精子膜中含有大量的多不饱和脂肪酸，极易受到ROS的攻击。因此ROS引起膜多不饱和脂肪酸减少，造成精子的流动性和通透性发生改变，导致精子的运动性和完整性发生不可逆的损伤。与此同时，ROS也会造成线粒体膜的损伤，使线粒体的呼吸功能发生改变，精子线粒体产生的能量减少，精子的运动能力降低[1]。

（二）DNA损伤

DNA作为遗传物质的传递者，其损伤直接影响精子质量以及受精卵的产生。氧化应激会通过自由基的产生引起精子DNA发生单链或双链的断裂[2]，同时也由于线粒体DNA是裸露的DNA，缺少蛋白质的保护和本身修复损伤能力较弱，常常导致精子直接损伤。有理论认为精子DNA损伤主要由于有功能缺陷的精子线粒体ROS产生[3]，而且大量线粒体ROS产生与缺陷精子功能，尤其是精子活动力显著相关[4]。也有研究认为染色质重塑不良也是精子DNA损伤的来源[5]。ROS及其代谢产物也会对细胞产生毒性，引起细胞凋亡，直接造成精子损伤[6]。

1. 广东省梅州市第一人民医院泌尿外二科（梅州 514031）; 2

. 吉林大学第一医院男科; 3. 吉林大学第一医院心理卫生科

（三）蛋白质损伤

由于ROS可以诱导蛋白质硫醇基过氧化会使精子的功能和结构发生改变，使精子更容易受到损伤，此外大量ROS的产生还可引起顶体结构的损伤，从而降低精子的受精能力。此外，精子体外培养以及ART中精子的冷冻保护都会影响精子的功能和结构的变化，造成精子膜脂质过氧化、DNA和线粒体损伤等一系列变化。

二、抗氧化剂的应用

（一）维生素C

维生素C也称抗坏血酸，是可生育男性精液中主要的抗氧化剂，其在精液中的浓度是血浆中的10倍[7]，同时在全部断链抗氧化剂中，它的抗氧化能力占到了65%。有研究显示，正常生育男性精液中维生素C含量为（448.71±93.18）μmol/L，不育男性则为（412.81±114.51）μmol/L，两组比较有统计学差异[8]。同时发现两组含量与正常形态精子数显著相关。Akmal等对13例年龄在25～35岁的不育男性给予维生素C 1g，1d两次，连用2个月，发现患者精子浓度、精子活力、正常形态精子数显著增加，认为维生素C可以作为一种改善精子质量的药物[9]。Fanaei等[10]最近研究发现畸形精子症精液中添加维生素C保护氧化应激损伤，能够提高辅助生殖成功率。

（二）维生素E

维生素 E又名生育酚, 是精子抗氧化系统中最重要的组成成分，也是对抗ROS和脂质过氧化发生的一种主要的保护精子膜的抗氧化剂[11]。一项研究报道，对690例特发性少弱精子症的不育男性给予每日200μg硒元素联合400单位维生素E连服100d，发现52.6%的患者精子活力和形态明显改善，10.8%的患者自然怀孕，认为联用硒和维生素E可以改善精子质量[12]。Tunc等[13]对50例不育男性患者给予复合营养片Menevit（包括番茄红素、维生素C、E，硒、叶酸）治疗3个月，发现患者精子DNA完整性和鱼精蛋白含量显著改善，同时伴随精浆ROS生成减少和凋亡下降，而对精子活力、浓度及形态未见明显改善。

在冷冻精液方面，Taylor等[14]研究发现冷冻保护剂中添加200μmol的维生素E可以显著改善冷冻复苏后精子活力，但对精子存活率及DNA碎片无影响，此外还发现这种保护作用对年龄超过40岁的男性较明显。而Kalthur等[15]发现冷冻保护剂中添加5 mM维生素可以显著改善正常精子及弱精子症患者冷冻复苏后精子活力以及DNA完整性。

（三）肉碱

肉碱（carnitine）又名肉毒碱或卡尼汀，几乎存在人体所有细胞，其存在L-肉碱和D-肉碱两种分子形式，前者在人体内具有生物活性，肉碱大多数都能在生物体内合成，在雄性动物和男性生殖道中，肉碱主要集中于附睾中，由于附睾本身不具有合成肉碱的功能, 所以主要通过肉碱转运蛋白从血浆中摄取。L-肉碱作为转运脂肪酸进入线粒体的重要载体，对精子运动的启动、精子成熟的促进和精子受精能力的提高,最近研究显示carnitine主要通过增加LDH-C4活性，从而影响受孕率[16]。以及在精子活动中所需的能量代谢和降低精浆中ROS含量、降低氧化应激反应、保护精子膜的稳定性、抗精子凋亡等活动起到了重要的作用。肉碱还参与精子膜表面糖复合物的生成，进而影响男性生育能力[17]。Lenzi等[18]发现100位少弱畸形精子症患者每天服用肉碱2 g治疗6个月后，精子浓度和移动力显著提高，第2年发现56位不育男性患者服用左旋肉碱（2g/d）和乙酰肉碱（1g/d）6个月后其精子数目和活力也提高。同时，一项关于219位患有精索静脉曲张患者采取上述同样的方法治疗4个月后发现精子浓度、移动和形态也明显改善[19]。Balercia等[20]也对60位弱精子症患者采取不同剂量的左旋肉碱和乙酰肉碱联合应用发现精子移动速度也明显提高。

（四）己酮可可碱

己酮可可碱（pentoxifylline, PF）是非选择性磷酸二酯酶抑制剂，属于黄嘌呤衍生物的一种。己酮可可碱与其他黄嘌呤衍生物相比，具有较高的水溶性，作用时间更长，作用效果更好，它能够阻断环腺苷酸（cAMP）转变为腺苷酸（AMP），使胞内cAMP升高，而cAMP在精子代谢中起到关键的作用，作为第二信使通过激活PKA（cAMP依赖性蛋白激酶），使靶细胞蛋白磷酸化，从而涉及到多种精子功能的调控所带来的效应，如促进顶体反应[21]，改善精子的穿卵活动以及保护精子质膜等作用。一项随机对照安慰剂双盲实验研究显示，PF400mg 一日两次，服用24周，在精子浓度，精子活力、正常形态精子数显著高于基线水平，SOD样活性和过氧化氢酶活性也显著高于安慰剂组[22]。Amer等[23]研究发现添加己酮可可碱制备的精液，其精子穿卵率、受精卵子数、胚胎总数、优质胚胎数、移植胚胎数均明显高于未添加组，妻子受孕率也高于未添加组。

（五）超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是生物体内抗氧化防御体系的重要酶类，是精浆中主要的抗氧化物酶类，其活性与精液质量直接相关[24]。SOD活性降低或含量减少则抗氧化功能受到抑制，从而导致体内大量自由基的蓄积，引起脂质过氧化，超氧离子介导的组织损伤等一系列反应，产生细胞毒性作用。研究发现，精液中SOD活性下降是导致男性不育的原因之一。在精子悬浮液中加入外源性的SOD能够保护精子线粒体和质膜，以及对抗精液中白细胞产生的ROS的损害以及保护精子的移动力和尾部摆动频率[25]。同时，在精子冷冻保存中发现，精子冻后SOD含量与冻后精子移动力的恢复呈正相关[26]，这间接的反应SOD含量与机体抗氧化能力的强弱有关。

（六）过氧化氢酶

过氧化氢酶（catalase，CAT）是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%，存在于所有需氧细胞中，能够催化过氧化氢转变为氧分子和水，是生物防御体系的关键酶之一，在男性不育中与超氧化物歧化酶具有同等的地位。研究中发现人的精子和精浆中都有过氧化氢酶,但精浆中的过氧化氢酶活力要显著高于精子。与此同时，研究人员在上述实验中又进行了更深入的研究，他们对评估精子参数的指标更为细化，其测定指标包括了精子的活率、活力，线粒体膜蛋白，细胞凋亡及DNA损伤、ROS的产生。结果显示，添加CAT可以提高精液质量、减少ROS的生成并降低了DNA损伤[27]。此外，Moubasher等[28]发现在新鲜或处理后的精液中添加CAT进行冷冻复苏，能够提高精子的前向运动力、活力和DNA完整性，这可能是由于CAT的添加抑制ROS的产生从而降低冷冻过程中所引起的氧化应激损伤。

（七）还原型谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是一种由3个氨基酸组成的小分子肽，它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。Varghese等[29]研究发现甘油冷冻保护剂中加入5 mM GSH，可以增加人冷冻保存精子DNA完整性，但并不能减少脂质过氧化或提高精子活力。 而Gadea等[30]发现冷冻复苏后精液GSH可以减少64%，添加1mM或 5 mM GSH可以提高精子活力及前向运动精子数，对精子存活率无改善。

（八）植物天然抗氧化剂

白藜芦醇（resveratrol, RES）是一种生物性很强的天然多酚类物质，一种天然的抗氧化剂。 RES主要通过清除或抑制氧自由基的产生和脂质过氧化，调节抗氧化相关酶活性等机制发挥抗氧化作用。Garcez[31]研究发现RES可以减少精子冷冻引起的氧化损伤，但对冻融引起的精子活力和形态损伤没有明显的抑制效果。

槲皮素（quercitrin, QU）具有多种生物学活性的黄酮类化合物。它存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在。Ben Abdallah等[32]研究表明槲皮素可以改善精子抗氧化酶的活性，保护精子免受过氧化氢对精子活力和脂质过氧化的损害。Zribi等[33]研究发现精子冷冻保护剂中加入槲皮素可以显著改善冻后精子活力、活率、DNA完整性。

展 望

面对当前男性不育所带来的问题，ROS的过量产生导致精子氧化应激损伤已成为人们关注的重点，研究氧化损伤的来源与机制是解决该问题的关键。而在寻求解决该问题的过程中发现，抗氧化剂的使用在防止ROS产生、降低氧化应激损伤以及提高精子质量中发挥着至关重要的作用。如何选择抗氧化剂的种类与浓度、冷冻保护液与精液的比例，并将这些抗氧化剂应用于临床，还有待进一步研究。

不育, 男性; 精子; 氧化性应激

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（2014-06-26收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.019

R 698.2