精子DNA损伤及其检测

孙海龙 综述 陈秀娟 审校

内蒙古医科大学附属医院妇产科生殖中心 （呼和浩特 010059）

精子DNA损伤及其检测

孙海龙 综述 陈秀娟 审校

内蒙古医科大学附属医院妇产科生殖中心 （呼和浩特 010059）

随着辅助生殖技术的发展，精液常规分析已不能全面评估男性生育能力。研究表明，精子DNA损伤是男性不育、复发性自然流产(RSA)以及辅助生殖技术治疗失败的重要原因之一[1]。

一、精子结构特点

精子作为一种终末分化细胞，成熟精子携带由基因和环境共同决定的遗传信息，直接影响下一代生命的形成与存在状态。精子发育过程中发生一系列的形态变化、胞内重要结构的重排以及代谢途径和方式的改变等，这些变化都是精子为适应环境而进行的自身调整。精子细胞核约占精子头部的65%，是精子最重要的细胞器，由DNA和鱼精蛋白（protamine，PRM）组成。在精子发生过程中，生精细胞核内与DNA结合的蛋白，经历组蛋白到过渡蛋白再到鱼精蛋白的组型转换。单倍体圆形精子细胞刚形成时，染色质仍呈核小体结构，过渡蛋白（Transition proteins, TPs）开始出现,并逐渐取代染色体中的组蛋白, 直至替换掉90%以上的组蛋白，随后鱼精蛋白开始出现并逐渐取代过渡蛋白,最终将精子核包装成高度浓缩的特异结构，从而保护精子免受外界因素损伤。

二、精子DNA损伤机制

（一）氧化应激

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。

生理情况下，少量ROS存在，是精子发挥正常功能如获能、顶体反应，以及精卵融合所必须的。精子质膜中含有高浓度的不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PURA），只含有低浓度的ROS清除酶。精子细胞内的自身抗氧化系统极其有限，且细胞内的抗氧化酶并不能保护精子顶体和尾部的质膜，这就迫使精子必须依靠精浆中的抗氧化系统。精浆抗氧化系统（total antioxidant capacity，TAC），分为两类，一类为酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等；另一类为非酶抗氧化系统，包括维生素、微量元素等[2]。精液中的ROS和精浆抗氧化能力保持平衡，当精液中的ROS增加或精浆抗氧化能力减低时，这种平衡被打破，从而导致氧化应激的发生[3]。超氧化物可使精子在氧化应激的作用下发生脂类过氧化反应，使精子膜的流动性和完整性受损，精子DNA更易暴露于外界环境中而受到损伤[4]。

（二）凋亡异常

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束生命的过程。凋亡是精子发生过程中的一个重要环节，自发凋亡对维持正常精子数量及精子质量非常重要[5]。有证据提示，许多质量不好的精液中缺乏精子正常凋亡。生精细胞凋亡通过Fas/FasL及半胱氨酰天冬氨酸酶（Caspase）途径介导，该途径异常可导致DNA损伤的生精细胞逃脱正常的程序化死亡，不断增殖分化，导致DNA损伤精子数量增加[6]。如果一个DNA受损的精子不从机体中消除，就有可能与卵子结合、受精，导致流产或胎儿出生缺陷的发生。

生精细胞过度凋亡可导致精细胞减少（精子减少），这可能是导致男性不育的重要原因之一，在自然状态下，环境因素如激素、温度、化学药物、射线以及肿瘤等均可诱导生精细胞凋亡。

（三）精子核成熟过程异常

精子细胞核成熟过程中需要发生组蛋白向鱼精蛋白（PRM1和PRM2）的转变[7]。组蛋白被鱼精蛋白取代过程中常伴随生理性的DNA双链断裂，这些断裂如果不能及时有效修复便会引发DNA损伤[8]；鱼精蛋白与DNA结合后，鱼精蛋白分子内和分子间的巯基逐渐被氧化成二硫键，使精子DNA与鱼精蛋白结合更为紧密，精子核更趋浓集和稳定[9]。Prm1和Prm2在精子中恒定于0.8～1.2这一严格比例标准[10]，当鱼精蛋白合成缺陷或功能异常时，必然会导致精子染色质浓缩过程的异常，形成松散结构的染色质，引起精子DNA损伤。

三、精子DNA损伤原因

（一）微量元素缺乏

微量元素是精液的重要生化成分，对维持精子生存环境的稳定有重要的生物学意义，微量元素直接参与精子的构成，对精子的成熟、运动、获能及顶体反应等一系列生理功能产生影响。

锌（Zine，Zn）是二价的阳离子，能和许多阴离子结合，而且对电子亲和力特别高，所以锌能与许多基团和配体相结合。与锌结合的基团或配体所生成的络合物比较稳定。人体内锌的含量以精子中为最高，其次是前列腺、指甲和骨骼。锌能够延缓精子细胞膜的脂质过氧化，维持细胞膜结构的通透性和稳定性[11]，从而使精子保持良好的活力。硒作为体内抗氧化剂，参与消除体内产生的各种自由基，研究表明精浆中的硒能使人类精子细胞免受氧化性DNA损伤[12]。此外，精液中的镉能置换DNA锌指结构中的锌离子，导致DNA的修复受到抑制，同时也能诱导细胞膜结构上的过氧化导致精子DNA氧化损伤。

（二）生殖系统疾病

生殖道感染和非特异性炎症增加了精子DNA损伤，可能由于生殖道感染和非特异性炎症使精液中白细胞的数量增加，引起局部氧自由基增加，导致氧化应激，并最终损伤精子DNA[13]。生殖道人乳头瘤病毒（HPV）感染时HPV DNA可以非特异性、多位点方式整合入人精子染色体中，增加了精子基因的不稳定性，诱导精子染色体畸变，其结果必然造成精子DNA损伤[14]。

精索静脉曲张（varicocele ,VC）是引起男性不育的重要原因，黄宇烽[15]报道了VC导致不育的细胞分子机制，与生精细胞凋亡异常和睾丸组织、精浆中过量ROS导致精子DNA损伤有关。Zini等[16]研究显示，VC患者术后4个月的精子DNA碎片率较术前显著降低。

（三）温度异常

精子发生需要适宜的温度，哺乳动物阴囊温度一般比腹腔温度低2～8℃，适于精子的生成。精子的发生过程对温度非常敏感。研究发现，阴囊温度增高可导致精液质量和精子DNA完整性均下降[17]。其原因可能是：作用在睾丸和附睾的热应激导致冷诱导RNA结合蛋白（cold inducible RNA-binding protein，CIRP）表达减少，而使生殖细胞凋亡数量增多，造成生精能力丧失，也可能是组蛋白与鱼精蛋白的比率增加使精子DNA结构发生改变，导致精子DNA损伤。近期研究显示温度越高对精子染色质的破坏越大[18]。

（四）吸烟

关于吸烟对精子DNA的影响，国内外学者已进行了大量的研究。已有的研究结果发现，香烟烟雾中含有大量自由基，如H2O2、O2-，它们可使DNA发生氧化和过氧化损伤，导致DNA链断裂[19]；吸烟还会增加DNA的脆弱性。烟草中的尼古丁及其代谢产物中富含有诱导基因突变和致癌的物质，这些物质可使精子对酸性诱变剂的敏感性增高，导致精子DNA链断裂增加。

（五）环境污染物

环境因素与精子DNA完整性间存在一定关系。Rubes等[20]究发现，暴露于污染环境中的人, 精子DNA损伤率有显著增高。苯及其同系物甲苯、二甲苯与人们的生活密切相关，它们被广泛的应用于油漆、喷漆、印刷、橡胶、制鞋、五金机械及有关化工合成等许多方面，苯及其同系物作为脂溶性化合物，容易通过血-睾屏障进入睾丸。睾丸上皮细胞富含代谢酶类[21]，在这些酶的作用下，苯可产生ROS，从而诱发精子DNA氧化性损伤。

（六）射线及化疗药物

人们对电离辐射损伤的认识已有几百年的历史，电离辐射通过直接和间接效应对精子DNA造成损害。直接效应是指DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应是指DNA周围其他分子吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA[22]。近期有报道无线网络（WiFi）对精子的活力和精子染色质完整性都有影响[23]。癌症的化学疗法和放射疗法对DNA的损伤更是广为人知，许多肿瘤治疗药物都是以DNA作为靶点, 抗癌药物的使用会造成精子染色质的损伤，并且动物实验证实这些 药物不仅会引起DNA的断裂，还会引起精子DNA甲基化等表观遗传的变化[24]，因此对于尚未生育的癌症患者在治疗前建议进行精子冻存，以备后用。

（七）年龄

精子DNA完整性与年龄因素密切相关。Wyrobek等[25]，通过对20～80岁人群进行精子DNA完整性检测发现，年龄是影响精子DNA完整性的重要因素，随年龄增加，凋亡精子百分率增加，DNA完整精子百分率降低。

（八）辅助生殖技术

体外精液处理技术是辅助生殖技术中的常规操作，其目的是获得没有精浆、细胞碎片及病原微生物的精子悬液，得到足够数量形态及功能正常的精子。目前临床上常用的方法有上游法、密度梯度离心法和离心洗涤法。但很少有人知道这些处理技术对精子DNA完整性的影响。用上游法处理后变性DNA精子的百分数与未处理精液相比明显减少。与未处理精子相比，用2层和4层Percoll梯度离心处理后平均精子活力在相当大程度得到改善，但是变性DNA精子百分数增加。有文献报道冷冻过程中产生的活性氧，可导致精子DNA损伤[26]，冻存时间对于精子DNA完整性有影响，不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异，只有在经过一次上游法处理后染色质质量才会得到改善。此外，体外处理时间过长、离心步骤过多和离心速度过快，均会造成精子的物理损伤并形成过氧化物或其他残留物，ROS也会大量增加，造成精子DNA氧化损伤。

近年来，微流控芯片精子分选法已应用于临床，微流控芯片精子分选技术是利用流体在纳米尺寸管中形成层流，以及各层液体之间互不干扰的物理现象来设计芯片，利用精子活动性的自然特性，精子运动速度大于一定值的精子从原液中通过层流面游到另一个液流中，从而实现对活动精子的分选[27]。王维等[28]研究发现，微流控芯片法和传统上游法所优选出来的精子相比较，芯片法更能优选出低DNA损伤率的精子。

这些研究结果提示我们要重新看待辅助生殖技术中精液的处理方法，选择最佳的组合方式。

四、精子DNA完整性的检测方法

（一）精子染色质结构分析试验（SCSA）

SCSA的方法与原理是：染色质结构损伤精子的鱼精蛋白S-H没被氧化，形成松散结构的染色质，DNA在酸的作用下变性成单链。吖啶橙（AO）可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合呈聚合物形式发出红或黄色荧光。然后通过配有专用软件的流式细胞仪可进行数据处理得出SCSA参数[29]。SCSA的创始人Evenson，对SCSA参数用于男性生育力的评估和预测亚临床不孕进行了大量研究，得出评估人生育潜能的阈值：0～15%时具有高生育潜能；16%～29%具有中生育潜能；≥30%具有低生育潜能；80%～90%无生育能力[30]。SCSA是检测精子DNA损伤中使用较多的一种方法，被认为是检测精子DNA损伤的“金标准”[31]。

（二）荧光原位杂交技术（FISH）

FISH是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与介导分子结合，杂交后再通过免疫化学过程连接上荧光染料，在核中或染色体上相应的DNA序列上显示杂交信号。其最大优点是可以与间期细胞核杂交，对一些体外不能分裂的细胞如人的成熟精子尤为合适。

（三）彗星实验

基本原理是：DNA损伤断裂后，在强碱的条件下，DNA双链被打开，释放出断裂的DNA片段，暴露了负电荷，电泳时，在电场力作用下，从核内迁出，向阳极迁移，从而形成“彗星”状影像。DNA损伤越多，进入尾部的DNA碎片越多。结果的判断有不同方法，可根据计数一定量细胞中彗星细胞所占的比例，估计精子DNA损伤比率；还可以在显微镜下或在照片上测出彗星细胞的一些长度数值，如尾长和彗星细胞总长、尾长与头部直径比值等，评估DNA损伤程度。但用上述指标评估精子DNA损伤程度尚不全面。有人用“尾距”来表示精子DNA损伤程度，尾距为尾部DNA占总DNA的百分率与头、尾部中心间距的乘积。研究发现，尾距与精子DNA损伤程度可保持较好的线性关系，故该参数能较满意地用于多种情况下的彗星试验分析。

（四）原位末端标记法（In situ end-labeling，ISEL）

ISEL是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与细胞中断裂的单链或双链DNA相结合，并通过一定的显示系统使之显示出来。ISEL有两种：原位缺口平移法（In situ nick translation，ISNT）和末端转移酶介导的dUTP末端标记法（terminal deoxynu- cleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling ，TUNEL）。结果可用流式细胞仪、荧光显微镜或光学显微镜检测。

（五）精子染色质扩散试验（sperm chromatin dispersion test，SCD）

SCD是由Fernández等[32]，首先于2003年提出的一种检测精子DNA损伤的新方法，基本方法和原理是：精子包含鱼精蛋白，可作为精子主要的核蛋白与其他细胞进行标志性区分。运用核蛋白溶解液可以在精子细胞和其他细胞之间造成不同核蛋白的扩散速度。鱼精蛋白的扩散速度比组蛋白快，可用DNA靶向性染料染色分辨精子细胞和其他细胞。精子核蛋白扩散还可用来分析包含较多染色质断裂的精子细胞。没有大量DNA 断裂的正常精子细胞可形成由DNA延伸环组成的核晕，而有较多DNA断裂的异常精子细胞没有核晕，或者核晕很小。SCD 法正是运用核蛋白携带DNA扩散的原理，对精子DNA断裂程度进行检测。将精子悬液与琼脂糖混合铺于载玻片上，酸处理后溶解细胞去除核蛋白，用DAPI试剂染色，最后用荧光显微镜观察。由于荧光容易发生淬灭，晕环的大小在荧光显微镜下不容易区分，也不容易区分精子和其他精液细胞。Fernández等[33]，改进了SCD检测方法，用瑞氏染液染色，可在光学显微镜下观察结果。根据精子DNA产生的光晕进行评估，正常的精子DNA产生扩散的光晕，而损伤的精子DNA则不产生或产生很小的光晕。

（六）8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxydesoxyguanosine, 8-OHdG）测定法

8 -羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），是精子DNA氧化损伤较理想的分子生物学标记物，是ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物（DNA加合物是亲电性化合物及其代谢产物和生物体内的DNA形成的共价结合产物，是DNA化学损伤的最普遍形式）。ROS能直接与DNA分子反应,导致DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联等氧化性DNA损伤，其中最主要的致突变性损伤反应是C-8上鸟嘌呤与胸腺嘧啶碱基颠换性突变，产生8-OHdG。8-OHdG在体内稳定存在，从精子中提取的DNA在变性后依次用脱氧核糖核酸酶 、核酸酶及碱性磷酸酶消化DNA,然后通过液相色谱电化学检测器检测8-OHdG和脱氧鸟苷（dG）浓度，结果用OHdG/ 105dG表示，8-OHdG含量与精子DNA氧化损伤程度成正相关。

（七）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）

目前，PCR主要用来研究精子线粒体DNA完整性。PCR技术可更精细地研究精子DNA的完整性是否异常，较为客观可靠，可进行定量或定性研究。但PCR对样品的保存和放置时间等影响染色质结构完整性的变化因素较为敏感。因此。严格控制精子放置的温度与时间，对流式细胞精子染色质结构分析是非常重要的。

（八）激光拉曼光谱技术

精子质量评估普遍采用的是DNA核酸染料，虽然具有很高的灵敏性，但其对精子具有破坏性，因此，很难用测定后的样本进行下一步的活体实验验证。近来，Mallidis等[34]，采用拉曼光谱技术来检测精子DNA损伤。精子拉曼光谱主要是由糖、脂类、蛋白质和核酸等成分叠加而成，精子不同拉曼光谱频率对应地反映出精子内部物质组分的变化，这有助于从分子生物学水平进一步研究精子DNA空间结构的变化。拉曼光谱具有非侵袭性和无损检测的特点，因此，不会对活的生物样本造成损伤，结合生物信息学分析方法，有望对其与卵母细胞受精以后的胚胎发育做出准确的判断和预测[35]。拉曼光谱作为一种无损伤的生殖细胞评估技术，对临床有重大的研究价值，可望成为精子形态与功能的新的无创评估技术。

五、展望

目前，精子DNA完整性在男科学和生殖医学中的重视程度正在逐步提高，但精子DNA损伤发生的确切机制尚不完全清楚，其治疗还处于探索阶段。虽然目前已有多种精子DNA完整性的检测方法，但尚缺乏一种快速、简便、标准化且能够广泛普及的检测方法。随着对精子DNA完整性研究的逐步完善和发展，相信在不久的将来，有望研究出一种理想的检测精子DNA完整性的方法。

精子; DNA损伤

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（2014-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.020

R 321.1