间充质干细胞无异源/无血清培养基研发的现状和前景

张文成，常铭洋，王韫芳，裴雪涛



间充质干细胞无异源/无血清培养基研发的现状和前景

张文成，常铭洋，王韫芳，裴雪涛

100850 北京，军事医学科学院野战输血研究所全军干细胞与再生医学重点实验室/510000 广州，军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是广泛存在于成体骨髓、脂肪、牙髓及围产期脐血、脐带、胎盘等多种人体组织器官中，具有多向分化潜能、良好的体外扩增能力以及免疫调节功能的成体干细胞[1]，近年来在外科烧伤[2]、软组织填充[3]、终末期肝病[4]、心肌梗死[5]、糖尿病足[6]等疾病的治疗中展现出良好的安全性和有效性。2011 年开始，韩国 KFDA 先后批准的全球首个治疗急性心肌梗死的自体骨髓 MSCs 药物Hearticellgram-AMI、治疗软骨再生的脐带 MSCs 药物Cartistem、治疗复杂性克罗恩病并发肛瘘的自体脂肪来源 MSCs 药物Cuepistem，以及加拿大卫生部批准美国 Osiris 公司的干细胞药物Prochymal 的上市，是 MSCs 临床应用的历史性进步，为合理、合法、安全、有效地应用于多种疾病的治疗提供了新的契机。

在已知的众多组织中，骨髓来源 MSCs 是研究和应用较为充分的一种。然而，因其取材技术要求严格、对供体造成痛苦较大，在一定程度上限制了其应用。近年来，脂肪、牙髓、脐带及胎盘等组织 MSCs 分离技术的成熟，极大拓宽了 MSCs 的来源及其可能的应用前景。其中，脐带 MSCs 因较成年组织 MSCs 具有更低免疫原性和更强的体外增殖能力，在异体细胞治疗中显现出更为突出的优势。

由于组织中 MSCs 数量极其有限，为了获得足够用于临床应用的细胞量，需要在输注前对其进行体外扩增。干细胞制剂制备所用的培养基成分除了要遵循《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》所制定的“应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，残留的培养基对受者应无不良影响”的标准外，还要保证其“干性”、增殖及分化能力。尽管常规用于普通细胞培养的含胎牛/新生牛血清的培养体系同样适合 MSCs 的体外扩增和维持，但血清批次的不稳定性导致难以避免的异源性污染及培养细胞内残存的动物血清引发的免疫等问题为其临床应用带来诸多隐患[7]。基于人血清或其衍生物的人源化培养基以及无血清培养基的研发和应用为这些问题的解决提供了新的途径和方案。

1 人源化 MSCs 培养基

目前已有研究尝试利用自体血清、血浆或人外周血/脐血来源的血小板及其衍生物，如人血小板裂解物（human platelet lysate，hPL）等作为 MSCs 培养体系中异源性血清的替代物。自体血清无论是在伦理还是安全性方面都有一定的优势，但获得的自体血清量往往不足以支持自体 MSCs 体外扩增至临床应用所需的细胞数量级，而且大量采血对特殊人群造成的身体机能危害也不容忽视。Dahl 等[8]研究也证实，血清对 MSCs 的支持能力会随机体病理改变和年龄增长而退减，这些问题限制了自体血清在 MSCs 体外规模化扩增中的应用。异体血清由于存在免疫排斥风险、一些常规方法无法检测的病原体污染及可能涉及到的血液制品来源及交易等问题而被禁止在 MSCs 培养中应用。Lange 等[9]和 Abdelrazik 等[10]的研究证实，在添加 hPL 的培养基中培养扩增 MSCs，其成骨和脂肪诱导分化的能力会明显减弱，表面特异性标志的表达也发生改变，并由此导致其体外的免疫抑制和免疫调节作用的削弱。虽然这些研究可能存在血清来源的个体差异等原因，但这些问题都是基于人源血清的培养基在应用前亟待解决的问题。

2 MSCs 无血清培养基

对 MSCs 等成体干细胞的体外多能性维持和扩增机制研究的深入，极大推动了 MSCs 体外无血清培养体系的研发和建立。2008 年，Invitrogen 公司推出第一款 MSCs 无血清培养基 StemPro® MSC SFM，专用于骨髓来源 MSCs 的分离培养。StemPro® MSC SFM 对 MSCs 体外增殖具有良好的作用，而且能在相当细胞代数内维持 MSCs 分化的多能性，这为长期以来因含血清培养基的使用带来的异源性污染等问题提供了理想的解决方案。随后R&D、Stemcell、ScienCell 等公司也先后推出了商品化的 MSCs 无血清培养基。

目前市售的无血清培养基大多包括基础培养基和添加物两部分，有的商品化无血清培养基还包括促进贴壁的明胶、胶原等细胞外基质，以增加细胞的贴壁能力，提高细胞得率。基础培养基中的白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、脂质、维生素、激素以及微量元素等对维持 MSCs 的生长非常重要，而细胞生长因子则对其多能性维持和体外增殖起到决定性作用。Rodrigues 等[11]对维持 MSCs 增殖和多能性的细胞生长因子进行了系统的总结，发现单独或联合使用TGFβ、bFGF、VEGF、HGF、EGF、PDGF 以及 Wnt 蛋白家族 Wnt3a、Wnt5a 等细胞因子，可通过激活或抑制特异的细胞信号转导通路而维持 MSCs 的增殖和多能性，这些主要的信号通路包括 Wnt、Notch、FGF 及 MAPK 信号通路（Ras-Raf-Mek1/2-Erk1/2）等。

尽管现有的 MSCs 无血清培养基不仅维持 MSCs 的体外增殖和分化多能性，而且具有批次可控和化学成分明确的特点，应用中具有良好的安全性，对 MSCs 临床应用的规范化开展产生了重大的积极作用，但是，大多数已有的无血清培养基并不足以支持原代细胞培养，在原代细胞分离过程中仍然需要依赖低浓度血清实现细胞的获取，且部分培养基需要对培养瓶/皿进行包被以促进细胞贴壁和生长，从而大大增加了细胞操作过程的工作量和污染几率。此外，由于无血清培养基中大多以人源化重组蛋白、微量元素和生长因子的“鸡尾酒”式组合实现 MSCs 多能性的维持和体外扩增，所以目前在售的 MSCs 无血清培养基均价格昂贵，保存时间有限，使得广大干细胞研究及临床应用工作者望而却步。因此，寻找成分明确、无异源性蛋白而且成本较低的无血清培养体系对于 MSCs 的临床应用具有重要的意义。

3 基于小分子化合物的新型 MSCs 无血清培养基

小分子化合物是一类分子量低于 900 Da 的有机化合物，通常作为酶的底物或通过与其他生物大分子结合作用于特定的细胞转导通路（例如，酪氨酸激酶受体等），在 DNA 复制、细胞分化、肿瘤转移、细胞凋亡等过程中发挥重要的生物学作用。近年来，包括酪氨酸激酶抑制剂的一批小分子化合物药物也投入临床试用，证实其可以替代部分生产条件苛刻、服用复杂和价格昂贵的重组蛋白药物，对肿瘤发挥靶向治疗作用[12]，显示出可观的应用前景。小分子化合物因其成本低、批次质量稳定的优势而逐渐替换原有体系中的部分细胞生长因子，被应用于干细胞体外多能性维持和定向诱导分化的研究中。目前，部分小分子化合物已经替代细胞生长因子用于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的培养及定向诱导分化体系中，ESCs 保持了体外全能性和长期扩增及多向诱导分化潜能[13-15]。

初步研究表明，多种小分子化合物通过作用于 MSCs 多能性相关的信号通路而对其增殖和多能性维持发挥重要的作用。Saraswati 等[16]研究证实，Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂pyrvinium 可以有效提高 MSCs 的增殖并抑制其自发成骨分化能力。Heng[17]证实，在 ESCs 全能性维持中具有重要作用的 Rho 相关激酶抑制剂 Y-27632，同样也可以有效提高 MSCs 冻存复苏后的细胞存活率和贴壁生长能力。Hong 和 Kang[18]研究表明，在 MSCs 培养体系中加入 4 μmol/L Hedgehog 激动剂purmorphamine 可明显提高 MSCs 的增殖能力，同时有效降低细胞凋亡的发生。虽然 TGFβ 在 MSCs 的维持中具有重要的作用，然而 Chen等[19]研究表明，使用 10 μmol/L TGFβ 抑制剂SB431542可以高效促进胚胎干细胞和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）向 MSCs 诱导分化，并维持这类多能干细胞诱导分化获得的 MSCs 的多能性和体外增殖能力。上述研究提示，小分子化合物与生长因子的作用并非完全等同，作用机制也各异；此外，不同的小分子化合物之间具有协同或拮抗作用，这都是在基于小分子化合物的无血清培养基研发和应用中值得注意的问题。

4 结语

MSCs 的无血清培养基为其安全、有效、可控地应用于基础及临床研究提供了理想的培养扩增环境。然而，目前已有的无血清培养基尚不完善，对其细胞致畸作用的评价及其体内、外长期的安全性评估还有待进一步验证，不同培养体系中小分子化合物的组合方案也需要进行相应的改良。小分子化合物较细胞因子、生长因子更具稳定性、批次可控性和价格优势，更容易实现真正的成分确定培养基的研发和推广使用。通过高通量筛选合适的小分子化合物及其合理组合，可实现对 MSCs 无血清培养基中关键生长因子的替代和优化，从而研发出更加安全、高效、易于质量控制且成本低廉的 MSCs 无血清培养基，为 MSCs 无血清培养体系的建立和临床转化研究与应用奠定基础。

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国家高技术发展研究计划（863 计划）（2013AA020109、2012AA020501）

王韫芳，Email：wangyf2011126@126.com；裴雪涛，Email：peixt@nic.bmi.ac.cn

2013-11-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.009