重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展

薛淑雅，杨月峰



重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展

薛淑雅，杨月峰

230032 合肥，安徽医科大学研究生院（薛淑雅）；100850 北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室（杨月峰）

近年来，研究者致力于突破基因治疗的瓶颈，极大推动了基因治疗的发展。载体系统是基因治疗的基础，截止 2013 年 7 月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”网站登记注册的基因治疗方案中，重组腺病毒载体占 476 项（23.5%）。在 6 个亚群（A-F）、50 多种血清型的腺病毒载体中，5 型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特异性识别并结合多种正常组织高表达的柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）从而进入细胞发挥作用，基因转导效率高，因此，Ad5 是目前应用最广泛的腺病毒载体。

虽然 Ad5 对多种组织具有高效感染能力，但也存在脱靶效应这一缺陷。例如，正常肝脏细胞中 CAR 的表达高，系统用药可能会使大量病毒滞留肝脏，产生毒副作用，使得 Ad5 在临床应用中存在很大隐患[1]。因此，提高重组腺病毒的靶向性对于推动重组腺病毒的临床应用意义重大。那么，如何增强腺病毒感染或目的基因表达的靶向性呢？近年来，研究者尝试通过多种途径提升重组腺病毒的靶向性，大量文献报道主要是通过对基因转导靶向和基因转录靶向的调控，实现治疗的靶向性。我们对现有的研究进展作一综述。

1 基因转导靶向性策略

基因转导，简言之就是将目的基因导入到特定的细胞中。提高靶向性的实质就是提高重组腺病毒载体对特定细胞（组织）的感染效率，与此同时，降低其对其他细胞（组织）的感染效率。目前常用的策略包括：①改构腺病毒外壳，使其选择性地与靶细胞膜表面的特异性受体结合；②通过双功能分子和双特异性抗体介导靶向转导[2]等。

1.1 重组腺病毒外壳的改构与修饰

众所周知，Ad5 通过识别靶细胞表面的 CAR 受体进入细胞，其具体过程为：腺病毒的纤维顶球与靶细胞表面 CAR 受体等黏附、结合；然后，由五聚体基部的一段肽链精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）与细胞表面的“第二受体”整合素 αvβ3 和 αvβ5 识别并结合，通过受体介导的细胞内吞作用使病毒内化；最后，完成目的基因的转录、复制。基于此过程，针对参与病毒与靶细胞识别、病毒内化等过程的关键外壳蛋白，进一步进行结构改造与修饰，是提高重组腺病毒基因转导靶向性的最直接策略。

Ad5 外壳蛋白的改构或修饰，可提高其对 CAR 受体低表达的肿瘤细胞的感染效率，同时，降低对 CAR 高表达的正常组织的感染。Wickham 等[3]和 Murugesan 等[4]的研究结果表明在野生型纤维蛋白的 C 末端连接多聚 RGD，可识别 αv 整联蛋白，从而提高 CAR 低表达细胞的感染效率；进一步发现，改构后的病毒对 CAR 高表达的肝脏等组织的感染效率降低，因此无明显系统毒性；同时对卵巢移植瘤的感染效率选择性提高，治疗效果明显增强。另有研究表明，在纤毛结节区的 HI 环中插入与整合素结合的短肽（CDCGRDCFC，RGD-4C），可提升对 CAR 阴性细胞的感染效率和基因转导效率[5]。

不同血清型的重组腺病毒识别不同的表面受体，而 B 组腺病毒可识别肿瘤细胞和造血细胞高表达的 CD46 分子。为提高重组腺病毒对肿瘤或造血细胞的靶向性，研究者结合 C 族 5 型腺病毒和 B 族腺病毒，构建了具有嵌合纤维顶球的重组腺病毒载体，包括 Ad5/F11P、Ad5/3 和 Ad5F35 等。Lu 等[6]采用11p 型腺病毒（Ad11p）的纤维顶球替换 5 型腺病毒载体的纤维顶球，获得的杂合病毒 Ad5F11p 可显著增强对造血细胞的感染效率。此外，含有 Ad5 与 Ad3 嵌合型纤维顶球的重组腺病毒可明显增强对肿瘤细胞的感染效率[7]。同时，研究者惊喜地发现，将 5 型腺病毒载体的纤毛完全置换为 35 型腺病毒的纤毛，可使重组腺病毒的体内分布发生巨大变化，为实现系统给药打下基础[8]。因此，通过对重组腺病毒纤毛以及外壳蛋白的修饰，可使重组腺病毒具有特定的靶向性。

1.2 双功能分子或双特异性抗体介导的靶向性策略

双功能分子或双特异性抗体，即分子桥或抗体桥，其一端与腺病毒的衣壳蛋白结合，另一端与细胞表面特异性受体结合，从而将重组腺病毒导向靶细胞，该策略是提高转导靶向性的另一重要方式。肿瘤细胞表面往往高表达成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factors receptor，FGFR）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等分子。研究表明，它们与腺病毒外壳蛋白的双特异性分子可显著提高对头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌细胞（EGFR+）以及胶质细胞瘤（CAR 低表达）等多种肿瘤细胞的感染效率，同时又可减少肝脏毒性。另有研究表明，抗结节区抗体的 Fab 片段与 FGFR2 共扼结合，可提高重组腺病毒的治疗效果，包括提升目的基因表达量，降低肝脏和系统毒性等[9-11]。

分子桥或抗体桥虽可显著提高腺病毒基因转导的靶向性，但仍存在不足之处，如制备和鉴定双功能分子桥费时、费力，体内用药有时可引起腺病毒的清除，补体系统激活等，从而限制了其临床应用[12]。因此，积极改进制备工艺以及优化分子结构，可以推进其在临床上的应用。

2 基因转录靶向性策略

基因转录靶向性，是指在多种转录调控元件的调控下，实现目的基因在细胞内的高效、特异表达。其主要策略包括：①采用特异性启动子调控目的基因的表达；②采用条件复制型溶瘤腺病毒策略；③采用双启动子[13]、增强子[14]和乏氧调控元件[15]等策略。

2.1 特异性启动子调控策略

通过组织或肿瘤特异性启动子（增强子）等调控外源基因的表达，是提高治疗基因转录靶向性，减少毒性反应的重要途径之一。理想的特异性调控序列，应具有无泄漏、特异性高、可调控和表达效率高等特点。至今，已有包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）[16]和人端粒酶反转录酶（telomerase reverse transcriptase，hTERT）[17]的调控序列等多种肿瘤特异性启动子应用于该策略。例如，采用单纯的或经修饰的 CEA 特异性调控序列，控制胞嘧啶脱氧酶（cytosine deaminase，CD）基因的表达，可使自杀基因高效、特异表达，实现肿瘤的靶向性治疗[18-19]；由 hTERT 启动子调控腺病毒基因组，并携带细胞因子信号肽抑制剂 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）基因的重组腺病毒，能有效靶向肿瘤细胞并对正常细胞无毒副作用，因此被广泛应用于肝癌的治疗研究[20]。CEA、AFP、hTERT 等启动子虽可在恶性肿瘤细胞获得特异性表达，但仍存在一定的泄漏。因此，肿瘤的靶向性基因治疗需要寻找表达更严密、效率更高的肿瘤特异性启动子。

转录靶向的策略，是目前溶瘤腺病毒构建最常用的方法。在转录水平，通过肿瘤特异性启动子，如甲状腺球蛋白启动子[21]和前列腺细胞特异性抗原（PSA）启动子等，调控腺病毒复制必需基因的表达，可实现重组腺病毒特异性的复制。通过 PSA 特异性启动子和前列腺特异性增强子（PSE）调控腺病毒复制必需基因 E1A 的表达，构建的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒 CV706 可以有效地实现前列腺肿瘤细胞内特异性复制，从而进一步杀伤前列腺肿瘤细胞。该溶瘤腺病毒已完成 I 期临床安全性评价[22]。

除肿瘤特异性启动子外，可用于转录靶向调控的特异性启动子还包括神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）启动子、II 型肺泡上皮特异性启动子和细胞内细胞黏附分子-2（intracellular cell adhesion molecule-2，ICAM-2）启动子等组织或细胞特异性启动子等[23-25]。

2.2 条件复制型腺病毒策略

条件复制型腺病毒（conditionally-replicating adenovirus，CRAD），又称溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus），是指在肿瘤细胞中特异性复制并裂解肿瘤细胞，进而释放子代病毒，去感染周围的肿瘤细胞，通过级联放大效应最终消灭肿瘤。目前，CRAD 已被广泛应用于肿瘤的治疗与研究，并在动物及临床前研究阶段取得了令人鼓舞的结果。目前，有大量的相关临床试验正在开展。CRAD 的主要构建策略包括：①选择性敲除腺病毒在肿瘤细胞中复制不必需的基因，但这些基因对于腺病毒在正常细胞中复制却是必不可少的，如 ONYX-015 和 H101 等，其中 ONYX-015 处于 III 期临床研究阶段，而 H101 已在中国批准上市；②通过肿瘤（组织）特异性启动子调控腺病毒复制必需基因 E1A 的表达等。第二种策略是目前研究者普遍采用的一种应用较为灵活且具有广泛意义的方法，已在特异性启动子调控策略中阐述，接下来详细阐述第一种策略。

重组腺病毒 EIA 基因中 55 kD 蛋白区段缺失后，可使病毒在 p53 突变的细胞中选择性复制并裂解细胞，最具代表性的是美国 ONYX 公司研发的肿瘤特异性增殖型病毒 ONYX-015，目前处于治疗复发性头部和颈部癌症的 III 期临床试验阶段，治疗结直肠、卵巢、胰腺和口腔肿瘤的 II 期临床试验阶段，以及治疗消化道、食道和肝脏肿瘤的 I 期临床试验阶段[26]；dl922-947 和△24 则通过删除病毒单一保守区 E1A-CR2 区基因，使其失去与 pRb 结合功能，从而实现靶向溶瘤[27]；而 AxdAdB-3 则同时存在E1A 和 E1B-55KD 两处突变从而限制其只能够在 p53 和 pRb 同时缺失的细胞中复制[28]。此外，Doronin 等[29]报道，去除 E3 区而 ADP 过表达的溶瘤腺病毒可选择性地在分裂相的肿瘤细胞中复制，进而显著延缓肿瘤的生长。

CRAD 只在肿瘤细胞内复制，而在正常细胞中不复制，具有产生旁观者效应、溶瘤效应及明显提高治疗基因的表达效率等优势。

2.3 双启动子、增强子和乏氧调控元件等调控策略

多项研究表明，通过双启动子、增强子和乏氧调控元件等策略，可显著提高腺病毒的靶向性。转录控制的溶瘤腺病毒 CG5757，携带了两个肿瘤特异性启动子，包含 E2F-1 和人端粒酶反转录酶基因。临床前研究结果显示，CG5757 全身应用具有低毒性及更好的肿瘤选择性和更强的疗效[13]。此外，将乏氧调控元件整合入改良后的人 α-甲胎蛋白（hAFP）启动子后，大大提高了溶瘤腺病毒的选择性和抗肿瘤效应[15]。

3 腺病毒双靶向或多靶向策略

应用不同肿瘤特异性启动子分别来控制腺病毒复制必需基因，如 E1A、E1B 和 E4 等，并结合外壳蛋白修饰等方法，可实现更为安全的多靶向溶瘤腺病毒治疗。有学者首先利用 hTERT 启动子、存活蛋白启动子和 CEA 启动子分别控制 E1A、E1B 和 E4 基因的表达，同时将 5 型腺病毒的纤维蛋白替换成 35 型。结果表明，该重组腺病毒能够更安全、更有效地杀伤肿瘤[30]。

由刘新垣院士提出的癌症的靶向双基因-病毒治疗策略，是指分别采用不同的策略构建溶瘤腺病毒 Ad-TERT 和 ZD55，然后分别将多种抗癌基因加入 ZD55 及 Ad-TERT 系统中。结果显示，其疗效优于 ONYX-015、ZD55 或Ad-TERT[31-32]。研究证实，将分别携带不同基因的两个病毒联合使用，可以发挥其协同效应或互补作用，可增强其抗癌功能。这种双基因-病毒治疗策略，获得了良好的抗癌疗效，也是迄今不需用化疗辅助就可在动脉肿瘤模型中将肿瘤全部消灭的、极具发展前景的生物治疗方案之一[33]。

4 展望

重组腺病毒是临床应用最为广泛的基因治疗载体，但是目前仅有很少的方案进入 III 期临床试验。因此，要实现其在临床中的广泛应用，还有诸多问题需要解决，如靶向性、病毒抗体的产生等问题。将重组腺病毒与其他治疗手段，如放疗、化疗、免疫治疗等联合应用，将是基因治疗的重要发展方向。已有研究报道，将 ONYX-015 和化疗药物如5-氟尿嘧啶、顺铂等联合应用，可发挥协同抗肿瘤作用，且疗效优于单独化疗[34-35]。

此外，溶瘤腺病毒本身在刺激机体抗肿瘤免疫上有较大的优势，如肿瘤细胞溶解后释放大量自身抗原，为刺激机体产生肿瘤抗原特异性免疫反应提供了丰富的肿瘤抗原来源。利用溶瘤腺病毒作为载体，携带免疫调节基因或肿瘤相关抗原，感染肿瘤细胞后可作为肿瘤疫苗刺激机体产生针对该抗原的免疫反应。因此，如何将重组腺病毒与肿瘤免疫治疗有机地结合起来，以充分调动机体的抗肿瘤免疫反应，是重组腺病毒领域的一个重要研究方向[36]。

本课题组在腺病毒转录靶向调控方面开展了大量工作，建立了基于 Adeasy系统的转录靶向溶瘤腺病毒制备体系，并先后完成了具有端粒酶靶向和前列腺癌靶向溶瘤腺病毒的研制和体内外评价工作[37]，目前，正在完善临床前研究；此外，本课题组利用 Ad11p 腺病毒的 CD46 分子靶向作用，成功建立了具有造血细胞和肿瘤细胞靶向的 Ad5/F11p 重组腺病毒系统[6, 38]。在此基础上，进一步完善重组腺病毒靶向性策略，推动腺病毒基因治疗的临床研究，将是我们下一步工作的重点。

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国家高技术发展研究计划（863计划）（2012AA020807）；国家自然科学基金（30901379）

杨月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2013-11-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.008