孕妇外周血中游离胎儿DNA富集与分离方法及在无创性产前诊断中的应用

杨麒巍，于 杉 综述，张桂珍审校

（吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林 长春130033）

在我国，每年新生儿出生缺陷多达80万至120万，尽早进行产检筛查和诊断是最有效的应对措施，然而目前常规的诊断方法皆为有创性方法，对胎儿和孕妇都有一定的危险性，因此发展新的无创性产前诊断具有重要的临床意义。1997年Lo等[1]发现在孕妇血浆中存在着少量的游离胎儿DNA（Cellfree fetal DNA，cffDNA），为无创性产前诊断方法提供了新的途径。孕妇从怀孕第7周开始即可检测到cffDNA，在最初3个月内cffDNA含量每周增加约21%，在随后的3个月进入平台期，在分娩前又迅速增加，分娩后2小时内迅速消失。cffDNA的这一特点使其可以早期、特异地进行产前筛查和诊断，且不易受到以往妊娠的干扰，由此可见，孕妇血浆中的cffDNA是进行无创性产前诊断的理想材料。目前，cffDNA已经应用于胎儿性别鉴定、常染色体遗传病如β地中海贫血、软骨发育不全、RhD血型鉴定、非整倍体遗传病如21（18／13）－三体综合征等、性染色体连锁性疾病如X染色体连锁的血友病、脆性X综合征等遗传性疾病的无创性产前诊断中。

然而孕妇外周血中cffDNA含量极少，仅为血浆总游离DNA的19%左右，并且与大量的母体血浆游离DNA混杂在一起，给cffDNA的检测和分析造成了极大的困难，如何从孕妇外周血中高效富集cffDNA已经成为研究的焦点。目前，根据cffDNA分子与母体血浆游离DNA的差异分离cffDNA的方法主要可以归纳为cffDNA高效富集法和cffDNA特异性分离法，本文将对于以上几种方法与其相关研究以及在无创性产前诊断中的应用进行简要概述。

1 cffDNA高效富集法

1.1 凝胶电泳法

2004年，Chan等[2]发现，血浆中大多数cffDNA分子片段长度小于313bp，而大多数母体DNA分子片段长度大于313bp，根据这一重要特点，可以依据DNA分子片段长度的差异，特异性富集片段长度小于300bp的DNA分子，从而达到高效富集cffDNA的目的。

将DNA分子按照片段长度分开，最简单有效的方法就是凝胶电泳法。Li等[3]利用从孕妇血浆中提取到的游离DNA进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，然后参照DNA分子量标准分别切取DNA分子量为90－23，000bp等部位的凝胶，并回收其中的DNA片段，利用实时PCR（real－time PCR）方法测定其回收的DNA含量及来源。该实验首次利用琼脂糖凝胶电泳的方法分离出孕妇血浆中游离的小片段DNA，并且进一步证明了Chan等[2]关于孕妇血浆中cffDNA片段大多小于300bp，而母体游离DNA片段大多大于300bp这一结论，同时证明了大片段游离DNA（例如＞20kb）中不含有cffDNA。利用琼脂糖凝胶电泳富集cffDNA虽然存在分离不精确、回收效率低、容易引入外源性污染等缺点，但是可以有效地降低母体游离DNA背景的干扰。

此后，研究者们分别结合不同的检测方法，支持了利用琼脂糖凝胶电泳分离孕妇血浆中小片段DNA的可行性。Jorgez等[4]利用凝胶电泳法分离孕妇血浆中10－2，000bp长度的DNA片段，并对其进行全基因组扩增（Whole Gene Amplification，WGA），首次证明了凝胶电泳法分离的cffDNA可以通过WGA进行扩增富集，从而获得足够量的cffDNA用于进一步的基因检测。Li等[5]在Ding等[6]关于应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix－assisted laser desorption／ionization timeof－flight mass spectrometry，MALDI－TOF MS）技术研究孕妇血浆中总游离DNA单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的基础上，应用凝胶电泳富集后的cffDNA进行MALDI－TOF MS，极大地提高了 MALDI－TOF MS的灵敏度，同时基于此方法优化了单等位基因位点延伸反应（Single allele base extension reaction，SABER），克服了应用孕妇血浆总游离DNA进行SABER或同质质量延伸（homogenous MassEXTEND，hME）检测时灵敏度低导致无法检出的难题，极大地提高了利用cffDNA检测SNP位点的灵敏度，并且应用此方法成功进行了两例软骨发育不全婴儿的产前诊断，在软骨发育不全胎儿的cffDNA中检测到G1138A基因的突变，同时证明了应用经过尺寸分选后的小片段cffDNA与不经过尺寸分选方法比较，诊断的灵敏度和特异性显著提高，这一研究结果为单基因点突变的无创性产前诊断提供了新的方法，但是应用这种方法的成本十分昂贵，并不适用于大规模的临床推广以及普通实验室的应用。Li等[7]利用real－time PCR－肽核酸钳制（Peptide－Nucleic－Acid Clamp）技术结合电泳富集cffDNA，应用序列特异性实时荧光定量PCR（Allele－Specific Real－Time PCR）检测IVSI－1，IVSI－6，IVSI－110 以 及codon 39等基因的点突变，进行β－珠蛋白生成障碍性贫血的无创性产前诊断，采用较为简单的方法，降低了检测的成本，并且有利于利用cffDNA进行无创性产前诊断面向临床的推广。

除了上述方法之外，为了提高DNA分离的准确性、效率以及减少外源性污染，研究者们也在不断尝试应用一些基于电泳原理的更有效的方法，例如毛细管电泳[8]、阴离子交换高性能液体色谱（anion exchange HPLC）[9]、凝胶过滤纯化柱[10]、等速电泳（Isotachophoresis，ITP）[11]等方法，进行cffDNA 的分离，同时结合实时荧光定量PCR（Real－time quantitative PCR，Real－time qPCR）技术检测SNP位点，从而进行胎儿性别鉴定、常染色体遗传病胎儿血型鉴定等多种无创性产前诊断。

1.2 磁性分离法

根据磁性纳米微粒可以吸附DNA的原理，国内外已经开发出很多商品化的试剂盒，可以从血液或其他样品中提取出痕量的DNA分子。瑞特等[12]通过优化磁性微粒吸附过程中反应体系的异丙醇及其他盐离子浓度，控制磁珠特异性吸附孕妇血浆中的小片段DNA分子，从而达到高效富集cffDNA的作用，发明了一种利用磁性微粒法富集cffDNA的新方法。基于磁性微粒吸附原理，部分试剂公司已经生产出高效富集cffDNA的试剂盒，但仍无法完全去除样品中的母体DNA干扰。目前，磁性分离法几乎应用于cffDNA无创性产前诊断的所有领域。

1.3 甲醛预处理法

以往的研究认为，孕妇血浆中的母体DNA来自于凋亡的外周血细胞，基于这一理论，Dhallan等[13]将收集到的孕妇外周血用甲醛进行预处理，稳定细胞结构，防止外周血中细胞破坏，然后利用常规方法提取血浆中的总游离DNA，从而有效地减少母体DNA背景的干扰。应用PCR法进行13号染色体、21号染色体上SNP位点的扩增，通过计算拷贝数变化进行13／21号染色体数量异常的诊断，进而，应用这一技术成功进行了21－三体综合征的无创性产前诊断[14]。遗憾的是虽然这一方法在发现初期得到了部分研究人员的验证[15]，但是在此后重复性实验中并没有得到满意的结果[16]。

2 cffDNA特异性分离法

2.1 甲基化DNA免疫沉淀法

2002年，Poon等[17]通过对比发现，母体血细胞内DNA甲基化水平与胎盘细胞内DNA甲基化水平存在某些差异，而这种差异可以用来区分母体游离DNA和cffDNA。随后，Chim等[18]利用亚硫酸氢盐测序法分别对母体血细胞DNA及胎盘细胞DNA内的18号染色体上的maspin基因甲基化水平进行比较研究，发现其在胎盘细胞内呈低甲基化状态，而在母体血细胞内呈高甲基化状态。Tong等[19]利用这一结论，联合亚硫酸盐预处理及甲基化特异性PCR方法，成功对18－三体综合征进行了诊断。然而这种方法需要大量的初始cffDNA样本，并且在检测过程中破坏了cffDNA的结构，使检测结果存在一定误差，这些缺点阻碍了这种技术的发展和应用。

2009年，Papageorgiou等[20]利用甲基化 DNA免疫沉淀法（methylated DNA immunoprecipitation，MeDiP）联合高通量寡核苷酸队列分析技术，分别对于全血DNA和胎盘DNA的21、18、13、X和Y染色体进行了系统的比较，共发现2000多个甲基化差异区域（differentially methylated regions，DMRs），为非整倍体疾病的无创性产前诊断提供了大量的生物学标志资料。MeDiP是通过DNA甲基化位点特异性抗体与cffDNA中的高甲基化位点结合，将cffDNA中含有高甲基化状态而母血游离DNA呈低甲基化状态的区域特异性沉淀，从而在大量母体游离DNA中特异性分离出cffDNA。随后，研究人员应用MeDiP分离孕妇血浆中cffDNA，并利用Real－time qPCR针对21号染色体上优选的12个DMRs进行扩增并计算其拷贝数的比值，通过21号染色体DMR与内参基因拷贝数比值的差异进行21号染色体非整倍体疾病的诊断，实验结果表明，应用MeDiP结合qPCR技术进行多个DMRs的联合检测，并将扩增结果通过加权计算公式计算，可以准确的进行21－三体综合征的诊断，其灵敏度和特异度均可达到100%，并可以进一步应用到13－三体综合征、18－三体综合征、X或Y染色体数量异常等非整倍体性遗传病的无创性产前诊断[21]。MeDiP具有灵敏、准确、快速、简单且节约成本等诸多优点，并且在怀孕早期即可进行诊断。

2.2 扩增测序法

Fan等[22]利用配对末端测序法（Paired－end sequencing），利用单碱基分解技术直接测量孕妇血浆中cffDNA的长度分布情况，并且可以直接选取小片段的DNA分子进行测序和分离，但是通过这种分子计数方法并没有提高对于非整倍体遗传病诊断的灵敏性。同时该课题组基于配对末端测序法开发了一种基于长度差异研究DNA分子特征的新方法[23]。

Lun等[24]在以往研究的基础上，开发出一种数字化核酸尺寸选择方法（digital nucleic acid size selection，digital NASS），Digital NASS是在数字PCR的基础上，利用基因扩增原理，通过设置特定的杂交探针或扩增引物，特异性将共轭DNA中较短的DNA分子扩增，而较长片段的DNA分子则不能被扩增。Lun等用这种方法结合数字化相对突变剂量法（digital relative mutation dosage，digital RMD）和数字化相对染色体数量法（digital relative chromosome dosage，digital RCD），有效地提高了这两种方法的检出效率。克服了以往研究中[6]胎儿从母系遗传的基因突变无法被检测的限制。

2.3 微晶片法

Hahn等[25]设计了一种能够从孕妇血浆中提取cffDNA的微型装置，这个装置是利用等速电泳技术（ITP）结合聚乙烯对苯二酰酯（polyethylene terephthalate，PET）膜和电动捕集（Electrokinetic trapping，EKT）技术原理制作的微晶片，可以达到高载量、自动化提取孕妇血浆中cffDNA的效果，并可以在低盐的环境下进行DNA的富集，有效避免了高盐条件对于后续PCR反应的影响，同时易于操作，成本较低，适用于临床推广。

孕妇血浆中cffDNA的发现为无创性产前诊断开辟了一条全新的途径，然而cffDNA仅占血浆总游离DNA的4%－19%，并且尚未发现其特异性的遗传标志物，大量的母体血浆游离DNA背景使得cffDNA的应用受到很大限制。目前针对cffDNA的研究，主要使用的仍是母体血浆总游离DNA，而分离cffDNA的方法又各有其优缺点（见表1）。因此，如果能发展一种更加特异、高效地从孕妇血浆总游离DNA中富集分离cffDNA的方法，则可以极大地提高利用cffDNA进行无创性产前诊断的特异性与敏感性，扩展适用范围，促进其诊断技术的发展与临床的推广应用。

[1]Lo YM，Corbetta N，Chaberlain PF，et al.Presence of Fetal DNA in matermal plasma and serum[J].Lancet，1997，350（9076）：485.

[2]Chan KC，Zhang J，Hui AB，et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem，2004，50（1）：88.

[3]Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C，Kang A，et al.Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms[J].Clin Chem，2004，50：1002.

[4]Jorgez CJ，Bischoff FZ.Improving Enrichment of Circulating Fetal DNA for Genetic Testing Size Fractionation Followed by Whole Gene Amplification[J].Fetal Diagn Ther，2009，25：314.

[5]Li Y，Godelieve CMLP，Johan JPG et al.Non－invasive prenatal detection of achondroplasia in size－fractionated cell－free DNA by MALDI－TOF MS assay[J].Prenat Diagn，2007，27：11.

[6]Ding C，Chiu RW，Lau TK，et al.MS analysis of singlenucleotide differences in circulating nucleic acids：application to noninvasive prenatal diagnosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：10762.

[7]Li Y，Di Naro E，Vitucci A.Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta－thalassemia using size－fractionated cellfree DNA in maternal plasma[J].JAMA，2005，293（7）：843.

[8]Griess GA，Serwer P.Improving the length－fractionation of DNA during capillary electrophoresis[J].Electrophoresis，2001，22（20）：4320.

[9]Yanakawa H，Higashino L，Ohara O.Sequence－dependent DNA separation by anion－exchange high－performance liquid chromatography[J].Anal Biochem，1996，240：242.

[10]Ritz W，Steinfelder HJ.Spin column assay to study apoptotic DNA fragmentation in 10（5）－10（6）adherently growing cells[J].Anal Biochem，2000，287：183.

[11]Chen L，Prest JE，Fielden PR et al.Miniaturised isotachophoresis analysis[J].Lab Chip，2006，6：474.

[12]恰根有限公司.分离核酸的方法：中国，200980120955.8[P].2009－05－12.

[13]Dhallan R，Au WC，Mattagajasingh S，et al.Methods to increase the percentage of free fetal DNA recovered from the maternal circulation[J].JAMA，2004，291：1114.

[14]Dhallan，R.A non－invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood：apreliminary study[J].Lancet，2007，369：474.

[15]Benachi A.Impact of formaldehyde on the in vitro proportion of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Clin Chem，2005，51：242.

[16]Chung，G.T.et al.Lack of dramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehyde treatment[J].Clin Chem，2005，51：655.

[17]Poon LL，Leung TN，Lau TK，et al.Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem，2002，48：35.

[18]Chim SS，Tong YK，Chiu RW，et al.Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：14753.

[19]Tong YK，Ding C，Chiu RW，et al.Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma：theoretical and empirical considerations[J].Clin Chem，2006，52：2194.

[20]Papageorgiou EA，Fiegler H，Rakyan V，et al.Sites of differential DNA methylation between placenta and peripheral blood.Molecular markers for noninvasive prenatal diagnosis of aneuploidies[J].Am J Pathol，2009，174：1609.

[21]Papageorgiou1EA，Karagrigoriou A，Tsaliki E，et al.Fetal－specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21[J].Nat Med，2011，17（4）：510.

[22]Fan HC，Blumenfeld YJ，Chitkara U.Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell－free DNA by paired－end sequencing[J].Clin Chem，2010，56（8）：1279.

[23]Fan HC，Quake SR，inventors.Method of characterizing single DNA molecules based on length[J].US provisional patent application，2012，541.

[24]Lun FM，Tsui NB，Chan KC et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105：19920.

[25]Hahn T，Drese KS，O’Sullivan CK.Microsystem for isolation of fetal DNA from maternal plasma by preparative size separation[J].Clin Chem，2009，55（12）：2133.