分子生物学技术检测自然流产组织染色体异常

韩 松，林艳茹，马晓艳，滕 红

（吉林大学第二医院 妇产科，吉林 长春130041）

自然流产是妇产科的一种常见病，目前国内的定义是指妊娠不足28周、胎儿体重不足1 000g而终止者，发病的几率约为15%－40%[1]。在导致早期自然流产的众多因素中最常见的是染色体的异常，约占60%[2]。本文就近几年对染色体异常的多种检测技术的应用进展进行综述。

染色体的异常包括染色体结构异常和染色体数目异常，而数目异常则是最常见的原因。目前，临床应用最广泛的是绒毛培养结合染色体核型分析技术，能够发现所有染色体的数目异常和结构异常。但缺点是细胞培养周期长，需无菌取材、操作，对实验室、技术人员要求较高，另外对母源组织的污染也难鉴别等。同时这种方法还受分裂相数量、质量等的影响。自然流产组织一般都具有组织陈旧、容易污染、培养失败率较高等自身特点，限制了此方法在临床中的广泛应用。

近几年，随着分子生物学技术的不断进步，新技术、新方法层出不穷被逐渐应用于临床，为各种疾病的诊断提供重要依据和创新思路。目前，检测染色体异常的技术主要有SKY、FISH、羊膜腔穿刺培养、QF－PCR、MLPA等。

1 FISH技术检测染色体异常的应用

1.1 荧光原位杂交技术检测染色体异常的应用荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）技术是20世纪80年代末兴起的细胞遗传生物学方法中的一种新型技术，它采用特殊荧光素标记的DNA探针，对未培养的绒毛组织按照同源互补原则进行原位杂交，杂交后经过免疫显色，就能快速准确的判断染色体颜色和数目的异常。

1.2 FISH检测染色体异常的优势 在自然流产组织中染色体非整倍体异常是最常见的畸变类型，如21三体、18三体、性染色体及多倍体，嵌合体等，约占50%－60%[3，4]。①FISH 技术可直接应用于未培养绒毛细胞的分裂中期、间期分裂相等阶段②相比传统的G显带核型分析技术的费时耗力，FISH则只需在采集标本1－2个小时后即可做出诊断，明显缩短了检测时间。③早期自然流产组织培养失败率为5%－42%[5，6]，对于自然流产组织的陈旧，易污染，培养的时间长失败率高[7]等问题，FISH则是解决它们很有效的手段。④在传统方法检测染色体中无法辨别的染色体异常的病例，如染色体的突变，染色体的微缺失等方面的异常，FISH则能快速准确的做出诊断，具有特异性强，灵敏度高等优点。方小武、李红艳等检测了30例培养失败的绒毛组织标本，应用FISH技术检出染色体数目异常14例，使检测的准确率提高[8]。FISH技术用于检测自然流产组织染色体的异常时，避免了标本易污染导致的细胞培养失败、培养过程中染色体的变异等缺点，省去了制备染色体DNA和显微镜下分析核型等繁琐的过程，能快速诊断疾病，减少了患者焦虑的等待时间，具有较高的灵敏度和特异性。

1.3 FISH技术检测染色体异常中的缺点 应用FISH技术检测染色体异常时虽然有很多自身优势，但也因各方面的限制使其仍不能完全取代传统细胞遗传学方法，临床上若将FISH与常规染色体核型分析联合应用，则可为临床疾病的诊断提供更准确的依据。①探针种类有限，只能检测几种常见的非整倍体染色体异常，使得一些特异性区域无法检测而造成漏诊，因此商品化的探针数目有限而使FISH在应用上受到一定的限制。②可有假阳性或假阴性结果出现，即使是正常染色体标本，在FISH试验中也会出现异常的情况.③母体细胞受到污染时，FISH则不能准确检测到存在母体污染的女性胚胎。④价格昂贵，探针和实验仪器价格昂贵，对实验室条件要求高等。

2 CGH、QF－PCR、MLPA

2.1 CGH在检测染色体异常中的应用 CGH

（comparative genomic hybridization）比较基因组杂交技术，是一种新型的细胞遗传学技术，它是一种快速、系统、全方位的检测方法，可以检测整个基因组内染色体的获得与丢失。最初主要应用于肿瘤遗传方面的研究[9]，现被证实它也可以应用于临床细胞遗传学研究[10－13]。

临床上自然流产组织的标本，不仅培养失败率高，且大多数不能及时检测，而CGH分析检测陈旧组织时仅需要DNA，不需要培养，可直接从标本中获得，这样就可避免培养失败；CGH可直接对冰冻组织、陈旧组织等储存样本进行研究，只需少量的样本就可以对整个基因组染色体数目的变化做出诊断，具有较高的准确率。作为一种在FISH基础上发展起来的新型技术，它弥补了FISH探针种类有限和检测位点局限的缺点。

目前CGH技术已被广泛应用于自然流产组织染色体异常的检测，2009年 Menten[14]等将CGH与传统细胞遗传学技术结合流式细胞仪分析的100例自然流产组织和死胎标本中发现染色体异常核型为26例；2002年Stephenson[15]等用CGH 技术对285例反复流产患者，420例自然流产标本进行分析，发现染色体异常率为46%；2000年Fritz[16]等用CGH技术检测了60例早期自然流产样本，检测出染色体异常率约为72%。

2.2 荧光定量QF－PCR在检测染色体异常中的应用 荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF－PCR）技术是一种通过对短串联重复序列（short tandem repeat，STR）进行扩增，然后对染色体拷贝数目异常进行快速产前诊断的方法。最初应用于唐氏综合征的快速产前诊断。后来经过优化和改良，目前已被广泛应用于染色体异常的检测，主要用于产前诊断中13三体、18三体、21三体的诊断；同时也应用于性染色体异常的诊断，如XO和XXY。

QF－PCR具有以下特点：①快速。QF－PCR技术应用了自动软件分析仪器而使整个检测过程仅需几个小时便可完成，减少了患者焦虑的等待时间；②QF－PCR在鉴别母源性污染时比传统核型分析技术和FISH更具有优势。③其实验过程可实现自动化，对多个样本可同时进行批量检测，操作简单方便，适用于大批量、大规模的检测；④所需的标本量少、结果可靠。可多个位点对引物进行同步扩增，结果并不互相影响；⑤费用低，不需要特殊仪器更加经济。但是也有其自身的的缺点，如为了防止扩增片段中加入不必要的染色体部分，则需要找到更多的位点进行复合扩增，具有一定的难度。目前因为试剂盒的种类有限，QF－PCR技术还需要探索和完善。

在诊断染色体异常方面QF－PCR技术具有十分广阔的发展空间。Cirigliano等[17]利用 QF－PCR对43000例临床样本进行检测，结果显示凡涉及到21、18、13、X和Y染色体的非整倍体100%被检测出，一部分三体和嵌合体也被检测出，95%的临床相关异常被迅速检出以及异常妊娠可以及时终止而不用等核型分析的结果。Sellmidt等[18]使荧光定量QF－PCR与STR结合应用，检测了662例患者的13，18，21，X，Y号染色体，检测出12个样本常染色体数目异常，6个样本的性染色体异常，21和13的染色体均有易位及在一例样本检测中没有发现嵌合体，检测的结果和核型分析的结果相同，验证了这种方法应用于产前诊断常见染色体的非整倍体的准确可行性。最近Liao[19]等发现QF－PCR技术也可以用于检测表型不明显的染色体异常，这个发现又将产前诊断的发展向前推进了一步。

2.3 多重连接探针扩增技术在检测染色体异常中的应用 多重连接探针扩增（multiplex ligation－dependent probe amplification，MLPA）技术是于2002年被Schouten等首次提出的，是结合分子杂交、连接和PCR半定量的新技术。于一次单一反应管内可同时检测40个核苷酸序列拷贝数的变化，具有高通量、高分辨率以及成本低等优点。目前被广泛应用于多个领域、多种疾病的研究。

MLPA技术具有高度的特异性，目前已针对容易发生畸变的热点基因如18、13、21、X、Y染色体设计了特殊的探针，可以通过观察基因数目的变化而判断染色体的异常。该技术还可以利用探针信号的异常检测出染色体三体型，部分嵌合体和染色体结构畸变。在自然流产样本染色体的分析中，它能检测已知区域的微小缺失、重复或突变，补充了传统细胞遗传学分析中的不足。MLPA作为核型分析的补充手段之一，具有高效、特异性高、方便快捷、价格低廉等特点。国内外均有研究将该技术用于胎儿、新生儿及流产组织的非整倍体检测[20－22]。

综上所述，随着现代分子细胞生物学技术的不断发展，尤其是快速产前诊断技术和自然流产染色体检测技术等领域提供了巨大的发展空间。但是目前每种技术并不完美，存在自身局限性和缺陷，这也给其在临床中的广泛应用带来一定的困难。省时、简便、快捷、价格便宜的诊断方法是我们共同努力去实现的目标，相信随着分子生物学技术和细胞遗传学技术的不断创新和进步，新技术新方法的不断涌现，将会为我国优生优育做出重要的贡献。

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