Nrf2-Keap1 信号通路与脑卒中

张 宇综述，张 兵审校

脑卒中已成为世界上导致死亡和神经功能障碍的主要原因，严重危害人类健康。目前认为，缺血性脑组织损伤是由多种因素参与的复杂病理过程，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸中毒、氧化应激损伤、炎症反应等多个环节。目前最主要的治疗措施是溶栓血运重建，矛盾的是，这会引起更严重的缺血-再灌注损伤。越来越多的证据证明刺激内源性抗氧化系统的表达将会是治疗脑卒中的主要措施。其中以核因子E2 相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)为核心的Nrf2-Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)信号通路被认为是一种新型的抗氧化信号通路，对维持细胞内氧化还原稳态起重要的作用，其调控的一大批下游分子具有抗氧化应激、调节炎症损伤、抗细胞凋亡、缓解钙离子超载等多重功能。本文我们重点阐述Nrf2-Keap1 在脑卒中中的神经保护作用及其机制。

1 Nrf2-Keap1 信号通路分子基础

1.1 Nrf2 的基本结构 Moi 等［1］最初发现Nrf2 是一种分子量为66000 的蛋白质，属于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic region-leucine zipper)，即CNC 亮氨酸拉链转录激活因子家族。目前为止，该家族已被证实包括6 个成员:NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1 和Bach2。其中Nrf2 在机体中广泛存在，对正常发育必不可少。Nrf2 分为6 个结构域，分别被命名为Neh1-6［2，3］。(1)Neh1 区:含有一个碱性亮氨酸拉链结构(basic leucine zipper，bZip)，必须与细胞核内小Maf 蛋白(包括MafG、MafK、MafF)结合形成异二聚体后才能识别并结合抗氧化反应元件(antioxidant responsive element，ARE)，启动目标基因转录;(2)Neh2 区:与胞浆蛋白Keap1 的Kelch 区相结合，负性调节Nrf2 的转录活性;(3)Neh3 区:由位于Nrf2 C-末端的16 个氨基酸组成，与活化转录密切相关;(4)Neh4 和Neh5 区:是2 个独立的激活区，富含酸性氨基酸残基，通过与共激活剂(如CBF)结合发挥强大的转录活性;(5)Neh6 区:富含丝氨酸残基，已知功能甚少，可能与氧化应激细胞细胞核内Nrf2 的降解有关。

1.2 Keap1 的基本结构 Keapl 为一种锚定于胞浆肌动蛋白细胞骨架上的多肽类物质，其一级结构含有624 个氨基酸，由NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、和CTR5 个结构域组成［4］。其中，BTB/POZ 区介导蛋白的二聚化作用;C-末端DGR 区包含6 个双链甘氨酸重复片段，为Keapl 与Neh2 的结合位点，可抑制Nrf2 转位至细胞核内发挥作用［5］;IVR 富含半胱氨酸残基，对亲电子剂或氧化物高度敏感。亲电子物质对半胱氨酸巯基修饰，可引起Keapl 的DGR 结构域构象发生改变，从而导致与其结合的Nrf2 释放。

2 Nrf2-Keap1 信号通路在脑中的调节机制

研究证实在氧自由基(ROS)及亲电子物质引起的内源性和外源性应激反应中，Nrf2-Keap1 途径在其中起主要的调节作用。在生理条件下，Keap1 与Nrf2 结合，通过泛素-蛋白酶体途径(the ubiquitin-proteasome pathway)可促进Nrf2 降解。Nrf2 半衰期小于20 min，这种迅速的更新使其在细胞质内保持低水平状态［6］。当机体受到氧化应激或亲电子物质的刺激时，Keap1 的半胱氨酸残基被修饰，Nrf2 稳定性降低，导致Nrf2 与Keap1 解离，进行核转移，与一种小Maf 核蛋白形成异二聚体，并与下游一系列解毒或抗氧化酶基因启动子序列的特定DNA 序列—顺式作用元件ARE 结合，从而激活这些酶的表达。在中枢神经系统中主要通过激活下游的血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)保护机体免受氧化活性物质(如ROS、RNS)及有害物质(如致癌物、药物代谢活化产物等)的侵害［7］。其中与GSH 合成、代谢相关的酶类主要包括谷胱甘肽过氧化酶1(Gpx1)、谷胺酸半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase，GST)等。

3 Nrf2-Keap1 信号通路在脑卒中的表达

永久性脑局部缺血后，对鼠大脑中Nrf2 的mRNA 和蛋白表达揭示，其表达呈时间依赖性，在3 h 时开始增加，24 h达到高峰，48 h、72 h 时下降，下降的原因可能是Keap1 激活下游的通路引起Nrf2 降解有关。增加的Nrf2 位于神经细胞、星形细胞的细胞核及细胞质［8］。Tanaka 等人［9］研究表明，在大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型中，Nrf2、Keap1 及下游抗氧化蛋白-GSH、HO-1 在梗死周围区域和梗死区的表达不同。细胞质中Keap1 的表达在MCAO 后显著下降，两个区域中其水平在再灌后2 h～24 h 下降，72 h 后保持在低水平，相反Nrf2 在梗死周围区域的表达于2 h 显著增加，8 h 达到高峰，24 h～72 h 时下降，并且两者的表达主要在神经细胞而非胶质细胞。梗死周围区域Nrf2-Keap1 信号通路调控的下游抗氧化蛋白的水平缺血后24 h～72 h 才开始增加。值得注意的是，在缺血梗死区下游蛋白表达显著减少，因此在梗死周围区域，Nrf2-Keap1 通路的激活可能发挥更重要的内源性神经保护作用。这两个研究的差异或许是因为所用模型的阻塞类型不同(永久性与短暂性)。在Nrf2-Keap1 信号通路表达的长期研究中进一步证实，Keap1 在8 h～3 d 的表达显著减少，然而Nrf2 在ICH 后2 h 显著增加，24 h 达到高峰，并且进一步发现ICH10 d 后，Keap1 和Nrf2 的水平几乎达到正常水平，两者表达部位与Tanaka 等人的研究一致。HO-1、GSH 和GST 基因水平在ICH 后早期阶段就有不同程度的增加［10］。在采用原代培养星形胶质细胞建立的短暂性缺血再灌注体外模型中证实，缺血再灌注0.5 h 后，Nrf2 由胞浆转移到胞核，随着再灌注时间延长，胞浆和胞核内Nrf2 均呈下降趋势。再灌注8 h 后，Nrf2 不再下降，表达水平趋于稳定［11］。以上研究中脑卒中后Nrf2 及Keap1 在神经血管系统的分布部位不同，还需要进一步的实验来明确。另有研究表明MCAO 后4 h～72 h，Nrf2 和HO-1 的蛋白在梗死周围区域的微血管的表达上调，HO-1 优先在血管周围星形细胞表达［12］。

4 Nrf2-Keap1-HO-1 在脑卒中的作用

HO-1 是体内血红素降解的催化酶，分解血红素生成Fe2+、一氧化碳(CO)和胆绿素，胆绿素又在胆绿素还原酶的作用下转变为胆红素(BR)，在体内发挥着重要的器官保护作用［13］。HO-1 的具体作用机制还不明确，其可能通过以下两种途径起作用:(1)酶解可能引起氧化应激和炎症反应的游离血红素;(2)抗炎物质BR、CO 的产生。许多研究已经证明生理状态下低水平的BR 通过清除ROS 发挥抗氧化应激的作用。HO-1 生成的CO 则参与凋亡、血管舒张和炎症等的调节。

Wang 等人［14］发现将永久性脑缺血的小鼠，缺血后立即暴露于250 ppmCO18 h，梗阻面积显著减少，并且Nrf2 与Keap1 的解离增加，促进Nrf2 核转移，HO-1 的表达也随之增加。而在Nrf2 基因敲除的小鼠中，这种保护作用消失。大鼠MCAO 模型研究证实，姜黄素［8］能够激活Nrf2 通路引起Nrf2表达的增加，同时出现梗死体积缩小、脑水肿减轻和神经功能改善。上述作用可能是通过上调Nrf2，诱导下游抗氧化酶和解毒酶表达，从而发挥了神经保护作用。利用培养的原代皮质神经元细胞建立氧和葡萄糖剥夺/再氧合(OGD/R)模型，姜黄素在体内的研究进一步证明了其在脑缺血中的作用［15］。Li 等人［16］证实在小鼠MCAO 模型中，熊果酸能显著改善神经功能，减少大脑梗死体积，并且脂质过氧化作用的产物丙二醛的含量，促炎因子TLR4 及NF-KB 的mRNA 和蛋白水平也降低。进一步证实Nrf2 和HO-1 水平提高，而在Nrf2 基因敲除鼠中有更严重的大脑损伤。乳果糖［17］和新橘皮苷(NH)［18］经口给予局部脑缺血的SD 大鼠后，能够显著改善神经评分，减小梗阻面积，减轻氧化应激损伤以及TUNEL 染色阳性细胞的数量。这些作用与Nrf2 及HO-1 的表达增多密切相关。另有研究表明促红细胞生成素(EPO)通过增加Nrf2 及HO-1 的表达，减轻脑水含量及梗阻体积［19］。莱菔硫烷缺血前预处理激活Nrf2 通路能够减轻血脑屏障损伤，改善神经缺陷［12］。以上研究提示通过诱导Nrf2的表达，激活Nrf2-Keap1-HO-1 途径可能通过抗氧化应激、抗炎症及抑制细胞凋亡作用，从而减轻脑卒中后的缺血再灌注损伤。

5 Nrf2-Keap1-GSH 在脑卒中的作用

GSH 是一种富含-SH，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的小分子三肽。GSH 是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，维持细胞内氧化还原稳态，可无需酶的参与，直接与过氧化物、NO、羟自由基等进行反应，从而把机体内有害物质排泄出体外，减少氧化应激对脂质、DNA 及蛋白质造成损伤，因此GSH 通常被认为是机体抗氧化能力的一个重要指标［20］。

Satoh 等人［21］在脑组织培养缺血模型中利用亲电子试剂NEPP 激活Nrf2 通路，发现GSH 和HO-1 水平明显上调，细胞凋亡数量明显降低，证实了Nrf2 及下游表达基因的保护作用。SD 大鼠脑皮质原代星形细胞培养，建立OGD/R 模型，二咖啡酰奎宁酸(1，5-diCQA)预处理显著抑制了细胞死亡，提高细胞活性，减少ROS 产量，并且使GCL 活性增加，促进了GSH 的从头合成。进一步运用Western Blot 方法显示1，5-diCQA 触发了Nrf2 核转移。而当用siRNA 转染细胞抑制Nrf2 表达时，这些保护作用消失。作者推测在体内缺血/再灌注模型中，1，5-diCQA 通过激活Nrf2 途径，上调GSH 合成，从而发挥抗氧化作用保护神经细胞［22］。

Karen 等人［23］利用体内OGD 模型和体外MCAO 模型发现，短暂的缺血预处理可引起脑缺血后Nrf2 目标基因的表达，并用real-time PCR 的方法证实与GSH 合成及利用有关的酶-GCL，谷氨酸盐/胱氨酸反向转运体(xCT)的表达也都增加。因此Nrf2 通过调控上述酶的表达来调节细胞内GSH含量，从而保护神经细胞。Nrf2-Keap1-GSH 通路对缺血再灌注和其它物质引起的氧化应激损伤都有保护作用。Burdo 等人［24］证实黄酮类化合物非瑟酮可以抵抗过氧亚磷酸盐引起的神经细胞氧化应激损伤，并且使Nrf2 的表达上调，GSH 合成的限速酶GCL 的含量增加。而加入GSH 合成抑制剂BSO后，神经保护作用消失。因此非瑟酮可以通过激活Nrf2 途径增加GSH 含量，增强细胞活性。另有研究发现，转染Nrf2 质粒的NRK-52E 细胞在氧化应激损伤时，GSH 表达明显高于对照组，并且应用基因沉默技术敲除Nrf2 基因后，NRK-52E细胞的GSH 表达与对照组相比明显降低，细胞存活率降低［25］。

6 展 望

目前Nrf2 在中枢神经系统的研究已成为研究热点，众多的研究已经表明，Nrf2-Keap1 信号通路在脑卒中中可能是通过激活下游HO-1 及GSH 的表达发挥抗氧化应激、抗炎症、抗凋亡等作用，但其具体机制还有待进一步阐明。同时我们也要关注Nrf2 持续激活可能带来的不利后果如癌症、动脉硬化等。虽然现在发现很多Nrf2 激动剂，但是这些物质能否应用于临床仍是未来研究面临的一大挑战。随着研究的深入，Nrf2-Keap1 将为脑卒中患者的治疗提供新的思路。

［1］Moi P，Chan K，Asunis I，et al.Isolation of NF-E2-related factors 2(Nrf2)，a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control regions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(21):9926－9930.

［2］Takagi Y，Kobayashi M，Li L，et al.MafT，a new member of the small Maf protein family in zebrafish［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(1):62－69.

［3］Nioi P，Nguyen T，Sherratt PJ，et al.The carboxy-termainal Neh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Biol，2005，25(24):10895－10906.

［4］Uruno A，Motohashi H.The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for electrophiles［J］.Nitric Oxide，2011，25(2):153－160.

［5］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，et al.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(7):2046－2051.

［6］Kansanen E，Kuosmanen SM，Leinonen H，et al.The Keap1-Nrf2 pathway:Mechanisms of activation and dysregulation in cancer［J］.Redox Biol，2013，18(1):45－49.

［7］Taquchi K，Motohashi H，Yamamoto M.Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution［J］.Genes Cells，2011，16(2):123－140.

［8］Yang C，Zhang X，Fan H，et al.Curcumin upregulates transcription factor Nrf2，HO-1 expression and protects rat brains against focal ischemia［J］.Brain Res，2009，1282:133－141.

［9］Tanaka N，Ikeda Y，Ohta Y，et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Brain Res，2011，1370:246－253.

［10］Shang H，Yang D，Zhang W，et al.Time course of Keap1-Nrf2 pathway expression after experimental intracerebral haemorrhage:correlation with brain oedema and neurological deficit［J］.Free Radic Res，2013，47(5):368－375.

［11］张 莹，卢 艺，曹 旭，等.Nrf2 在短暂性缺血再灌注大鼠星形胶质细胞模型中的表达变化及其意义［J］.中风与神经疾病杂志，2010，27(5):388－391.

［12］Alfieri A，Srivastava S，Siow RC，et al.Sulforaphane preconditioning of the Nrf2/HO-1 defense pathway protects the cerebral vasculature against blood-brain barrier disruption and neurological deficits in stroke［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:1012－1022.

［13］Paine A，Eiz-Vesper B，Blasczyk R，et al.Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential［J］.Biochem Pharmacol，2010，80(12):1895－1903.

［14］Wang B，Cao W，Biswal S，et al.Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2011，42(9):2605－2610.

［15］Wu J，Li Q，Wang X，et al.Neuroprotection by curcumin in ischemic brain injury involves the Akt/Nrf2 pathway［J］.PLoS One，2013，8(3):59843.

［16］Li L，Zhang X，Cui L，et al.Ursolic acid promotes the neuro-protection by activating Nrf2 pathway after cerebral ischemia in mice［J］.Brain Res，2013，1497:32－39.

［17］Zhai X，Chen X，Shi J，et al.Lactulose ameliorates cerebral ischemiareperfusion injury in rats by inducing hydrogen by activating Nrf2 expression［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:731－741.

［18］Wang JJ，Cui P.Neohesperidin attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury via inhibiting the apoptotic pathway and activating the Akt/Nrf2/HO-1 pathway［J］.J Asian Nat Prod Res，2013，15(9):1023－1037.

［19］Meng H，Guo J，Wang H，et al.Erythropoietin activates Keap1-Nrf2/ARE pathway in rat brain after ischemia［J］.Int J Neurosci，2013.

［20］Gebicki JM，Nauser T，Domazou A，et al.Reduction of protein radicals by GSH and ascorbate:potential biological significance［J］.Amino Acids，2010，39(5):1131－1137.

［21］Satoh T，Okamoto SI，Cui J，et al.Activation of the Keap1/Nrf2 pathway for neuroprotection by electrophilic phase II inducers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(3):768－773.

［22］Cao X，Xiao H，Zhang Y，et al.1，5-Dicaffeoylquinic acid-mediated glutathione synthesis through activation of Nrf2 protects against OGD/reperfusion-induced oxidative stress in astrocytes［J］.Brain Res，2010，1347:142－148.

［23］Bell KF，Fowler JH，Al-Mubarak B，et al.Activation of Nrf2-regulated glutathione pathway genes by ischemic preconditioning［J］.Oxid Med Cell Longev，2011，2011:689524.

［24］Burdo J，Schubert D，Maher P，et al.Glutathione production is regulated via distinct pathways in stressed and non-stressed cortical neurons［J］.Brain Res，2008，1189:12－22.

［25］Li J，Jin J，Li M，et al.Role of Nrf2 in protection against triptolideinduced toxicity in rat kidney cells［J］.Toxicol Lett，2012，213(2):194－202.