尼氟灭酸在大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收缩中的作用*

黄林静，何金波，王淑君，马迎春，应 磊，汪 洋，王万铁△

本室先前研究发现［1］，低氧高二氧化碳性肺血管收缩（hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV）过程是呈双向收缩反应（I期快速收缩、快速舒张；II期持续收缩），但单用钾通道机制和钙通道机制似乎不能解释该双向收缩过程。近年来研究报道［2，3］，存在于肺动脉平滑肌细胞的氯通道与细胞容量的调节、肌电活动及肌张力有关，氯离子通道的激活可以引起肺动脉平滑肌的收缩，但其参与Ⅰ期收缩还是Ⅱ期收缩亦或共同作用引发肺血管张力增高，至今尚未明了。本实验采用氯离子通道阻断剂--尼氟灭酸（niflumic acid，NFA）在急性低氧高二氧化碳条件下分别处理离体大鼠二、三级肺动脉环，动态观察其血管张力的变化，探讨氯离子通道在HHPV发生发展中的作用。从而为临床HHPV的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

离体组织灌流浴槽、张力换能器（西班牙 Panlab公司）；Power lab八道生理记录仪（澳大利亚 Ad instruments公司）；血气分析仪（日本希森美康医用电子上海有限公司；AVL COMPACT3型）；自动电子天平（GB303 type，METTLER TOLEDOGroup，Shang hai）；恒温震荡水浴仪（DSHZ-300，江苏太仓实验设备厂）；78-2型磁力搅拌器（江苏中大仪器厂）；Mettler Toledo 413型 PH计 SWITZERLAND；直型显微镊（18cm北京北方三友医疗器械有限公司）；眼科显微剪（北京中兴名业科技发展有限公司）。

1.2 药品和试剂

二甲基亚砜（DMSO）（上海申工生物技术有限公司）；重酒石酸去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）上海禾丰制药有限公司产品）；乙酰胆碱（acetycholine，Ach）（美国 Sigma公司）；NFA（美国 Sigma公司）；NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，Glucose，EDTA均为市场所售分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 制作二、三级肺动脉环 颈椎脱臼法处死大鼠后，开胸取出心肺，置于4℃Krebs液中迅速剪开右心室，剪除左右肺叶并洗净残血。然后快速、轻柔分离肺右侧二级、三级肺动脉（right main branch pulmonary artery）（注意不要过度牵拉血管和接触血管腔面以免损伤血管内皮），制成3 mm长的动脉环。动脉环穿过两个直径0.2 mm的三角形不锈钢小钩后，置于盛有10 ml Krebs液的恒温（37℃）离体血管灌注浴槽内，下端固定于槽底部，上端通过张力换能器与Power lab八道生理记录仪相连，记录肺动脉环张力的变化。

1.3.2 平衡血管、检测内皮细胞 预实验发现在本实验制备的二级肺动脉的最适前负荷为750 mg，三级肺动脉的最适前负荷为450 mg，调节张力微调器使最适前负荷在60 min内加至血管并维持平衡60 min，其间持续通入 95%O2＋5%CO2混合气体。达到平衡后的肺动脉环用NE（10-5mol／L）预收缩后观察 Ach（10-5mol／L）的内皮依赖性舒张反应，若出现85%以上的舒张反应（舒张张力占同组NE收缩张力的百分数）视为内皮细胞完整，否则弃之不用。最后，冲洗血管环平衡30 min，记录平衡张力值P0。1.3.3 血管环常氧反应性测定 实验期间持续向浴槽内通入95%O2＋5%CO2混合气体，每隔5 min记录平均张力值 （P）1次，并计算张力变化率 P（%）＝（P-P0）／P0×100%。

1.3.4 血管环低氧高二氧化碳反应性测定 实验前用92%N2＋8%CO2的混合气体充灌 pH 7.35的灌流液（37℃）约 40 min，将溶液瓶密闭，用血气分析仪监测灌流液的PO2及PCO2使其分别在30 mmHg（4.00 kPa）和 60 mmHg（8.00 kPa）的范围内。实验时将以上液体灌流入组织浴槽中形成急性低氧高二氧化碳模型。继续向浴槽液体中通入上述无氧气体并观察60 min，注意浴槽加盖，使浴槽中的灌流液 PO2＝30～35 mmHg［（4.00～4.67）kPa］，而 PCO2则在55～60mmHg［（7.33～8.00）kPa］的范围内。实验期间每隔5 min记录平均张力值1次，并计算低氧高二氧化碳所致的张力变化率。

1.3.5 肺动脉环对低氧高二氧化碳的反应性及尼氟灭酸干预 二、三级动脉环分别随机分为：常氧组（N组）；低氧高二氧化碳组 （H组）；DMSO组 （HD组）；尼氟灭酸组（NFA组，）。在急性低氧高二氧化碳介质中，用氯离子通道阻断剂NFA孵育肺二、三级肺动脉环，观察药物对低氧高二氧化碳性肺动脉收缩的影响，以明确其在HHPV中的作用，DMSO组为药物对照组，药物在配置中是以DMSO作为有机溶剂，对以上各组除N组外，均按照低氧高二氧化碳反应性测定的方法测定肺动脉血管环张力变化，HD组和NFA组分别是用DMSO（0.05%）和NFA（10-5mol／L），孵育20 min后按照低氧高二氧化碳反应性的测定方法测定血管张力。

1.4 统计学处理

采用SPSS18.0统计软件，计量资料均进行正态性检验，实验数据（张力变化率）以均数±标准差（¯x±s）表示，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间两两比较采用单因素方差分析，对每个相应的时间点上每个分组之间的作用做两两比较。方差齐性者采用LSD法，方差不齐者进行DunnetsT3法检验。

2 结果

2.1 低氧高二氧化碳对二、三级肺动脉环张力的直接影响

N组持续通入 95%O2＋5%CO2混合气体 60 min，张力变化率（PN%）无明显变化。H组持续通入92%N2＋8%CO2混合气体 60 min，PH%呈倒抛物线样变化；即在急性低氧高二氧化碳介质中，二、三级肺动脉呈现出双向性收缩变化（biphasic pulmonary artery vasoconstriction）（图 1、图 2）。其中 I期快速收缩峰最大 PH%为（36.86±12.94）%、I期舒张最大PH%为、（-1.78±8.44）%、II期持续收缩为最大PH%为（47.87±4.85）%。H组与N组相比，急性低氧高二氧化碳引起的二、三级肺动脉双向收缩变化有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，表 1、表 2）。

Fig.1 Dynamic graph of the second pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition

Fig.2 Dynamic graph of the third pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition

2.2 尼氟灭酸在急性低氧高二氧化碳介质中对二、三级肺动脉环张力的直接影响

急性低氧高二氧化碳条件下，用尼氟灭酸孵育二、三级肺动脉环后，I期快速收缩峰无明显变化，但II期的持续收缩显著减弱，与HD组相比，II期的收缩幅度明显下降（P＜0.05，P＜0.01，图 3、图 4，表 1、表 2）。

Fig.3 Dynamic graph of the second pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition in the niflumic acid（NFA）group

Fig.4 Dynamic graph of the third pulmonary artery rings’tension change under the hypoxia hypercapnia condition in the niflumic acid（NFA）group

Tab.1 The second pulmonary artery rings’tension change rate under the four conditions（%，¯x±s，n＝8）

Tab.2 The third pulmonary artery rings’tension change rate under the four conditions（%，¯x±s，n＝8）

3 讨论

氯离子是体内最为丰富的阴离子，参与细胞体积调节、静息膜电位和兴奋性的调节、细胞周期的调控等各种生理过程。研究表明［4，5］生物膜上存在多种类型氯离子通道，主要有（1）背景氯离子通道，此通道在静息膜电位具有显著的开放频率；（2）双筒氯离子通道，该通道具有特殊的门控机制；（3）最大氯离子通道，它具有相当高的电导；（4）钙激活性氯离子通道（Clca），为许多因子所激活。但在肺动脉平滑肌细胞上研究较多的是Clca、容量激活性氯离子通道（C1swell）。细胞膜氯离子的静息通透性相对较大，血管平滑肌细胞氯离子平衡电位（约-34 mv）比静息膜电位（约-55 mv）高，故钙激活性氯离子通道有较强的去极化作用，在调控血管张力和收缩性方面起着重要作用［6］。杨朝等发现［7］Clca在生理状态下参与了苯福林（phenylephrine，PE）引起的肺动脉收缩。据此推测：低氧高二氧化碳（可直接使肺动脉平滑肌细胞膜通透性增加）时细胞外钙离子内流增大；同时各种体液因子引起平滑肌细胞内钙离子水平持续升高，导致细胞内钙离子浓度增加，钙激活性氯离子通道开放，使氯离子外流，后者减少了细胞膜内侧的负电荷，从而维持去极化状态，钙离子进一步内流，活化Ca2＋-Ca M系统，激活平滑肌细胞的收缩蛋白，最终引发HHPV。尼氟灭酸是氯离子通道阻断剂，可显著抑制 Clca，还可完全阻断 C1swell［8］。因此，尼氟灭酸对低氧高二氧化碳性肺动脉高压可能具有一定的缓解作用。

本室先前研究发现，常氧状态下NFA对肺动脉环基础张力无明显影响。其原因是常氧状态下，［Ca2＋］i为 50～100 nmol，而激活 Clca的［Ca2＋］i是185 nmol／L，故Clca未开放。本研究结果显示：离体二、三级肺动脉环分别暴露于低氧高二氧化碳环境下1 h内发生了双相性收缩反应，这与Sylvester等［9］的研究结果一致。双相收缩通常包含两个部分：初始的快速而短暂的收缩（I期收缩）和随后的缓慢而持续的收缩（II期收缩期）。用NFA分别预处理二、三级肺动脉环后，暴露于低氧高二氧化碳环境中1 h内发现，其II期收缩幅度明显减少，最大张力变化率显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；然而，NFA对肺动脉环的I期收缩程度却没有明显的降低作用。说明在肺动脉环的II期收缩过程中，Clca的激活发挥了重要的介导作用。

本研究还发现，NFA对低氧高二氧化碳环境中肺动脉环的I期收缩虽无明显影响，但在一定程度上增强了 I期舒张。以往研究发现［10］，［Ca2＋］i升高先于低氧诱导的膜去极化，从咖啡因敏感型钙库释放Ca2＋是低氧高二氧化碳性肺血管收缩的早期事件。因此，低氧早期诱发的细胞内钙库释放钙引起［Ca2＋］i升高仅一过性的快速升高，从而引起肺动脉短暂而快速的收缩，但却不足以激活Clca。由此可见，NFA对HHPV中的I期收缩无显著影响。另外，此时可能只是钙库释放钙引起的短暂收缩，没有发生膜去极化，电压门控性钙离子通道没有被激活或细胞膜离子通道的钙内流不足以补充低氧时细胞内钙释放的耗竭，随着细胞内钙库钙离子的耗竭，兴奋-收缩偶联兴奋性随之减弱，从而发生随之的快速舒张作用（I期舒张）。另外，我们实验还发现药物组与HD组均无统计学意义，说明DMSO对我们的实验无影响，可以作为我们所用药物的溶剂。

综上所述，在急性低氧高二氧化碳介质中，二、三级肺动脉呈现出双向性收缩变化（I期快速收缩、快速舒张；II期持续收缩），氯离子通道阻断剂—尼氟灭酸可减轻大鼠二、三级肺动脉环的张力变化率（尤其是II期的持续性收缩），从而发挥拮抗HHPV的作用。

［1］ 朱阿楠，王万铁，林丽娜，等.MAPK通路抑制剂对低氧高二氧化碳性肺动脉收缩的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24（8）：1538-1542.

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