骶神经电刺激对脊髓损伤大鼠肠黏膜机械屏障的保护作用*

白春宏，刘 浩，李双英，彭 朋，宁丽娜

（1.武警后勤学院附属医院脊柱一科，2.脑科分院，3.中医科，天津300162；4.武警后勤学院军事训练医学教研室，天津300309）

急性完全性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）患者除了运动和感觉障碍，通常还有自主神经功能障碍，主要包括心血管、性、膀胱和肠道功能障碍［1］。其中，肠道功能障碍逐渐被认为是影响脊髓损伤患者身心健康的重要因素之一。SCI后肠道功能障碍主要表现为便秘、大便失禁、自主反射失调、腹痛腹胀等。在严重的情况下，还将出现肠道细菌移位和内毒素血症。Kamm等证实刺激骶神经可以改善SCI患者的排便的频率、粪便传输时间等。Uludag等也证实通过骶神经电刺激62例便失禁患者的研究发现，电刺激S3或S4可以诱导全结肠产生顺行压力波，可加快排便频率及数量。Bai等通过骶神经电刺激兔子的骶3神经根，发现刺激后兔子的肠道症状、菌群移位、内毒素血症得到改善［2］。完整的肠道功能为机体提供屏障保护，可防止肠道内微生物移位和内毒素吸收，主要包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以机械屏障最为重要。骶神经刺激（sacral nerve stimulation，SNS）对 SCI后肠道机械屏障的具体保护作用仍未被阐明。所以本实验旨在初步探讨SNS对SCI大鼠肠道机械屏障的保护作用，为其在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

Wistar大鼠56只，体重250～300 g（北京维通利华公司），雌雄不拘。鲎试剂盒购自广州安度斯生物有限公司，Rabbit anti-ZO-1、zeocin购自美国Invitrogen公司，Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG购自英国Abcam公司，氯化银银丝记录电极、双极刺激电极、98 g动脉瘤夹购自成都仪器厂。

1.2 实验分组

按随机数字表法分为正常对照组（N）、SCI模型组（SCI）和骶神经电刺激组（electriy stimulation，ES）。SCI（3小组，每小组8只，脊髓离断、骶神经不做刺激，脊髓离断时间分为24、48和72 h）和ES（3小组，每小组8只，脊髓离断、最佳刺激电压刺激骶3神经根，刺激时间分为24、48和72 h）。实验过程中如有死亡，采用同标准的大鼠用同样的办法补充。实验前置22℃～25℃室温，普通饲料喂养1周，使其适应。

1.3 急性完全性脊髓损伤模型建立及骶神经根电极置入

大鼠麻醉后俯卧位固定于鼠板上，定位T6棘突，刮毛刀刮毛，碘伏消毒。手术暴露脊髓，用神经剥离器轻轻挑起后，采用Fehlings法，用98 g动脉瘤夹横行钳夹约1 min，见双下肢抽搐停止。去除动脉瘤血管夹，冲洗伤口后缝合，无菌包扎。定位右侧骶3神经孔，脱毛剂脱毛后，局部消毒，暴露右侧骶3神经孔，置人电极，根据刺激时尾部肌肉是否收缩确定电极位置，冲洗伤口后缝合，导线置于皮下，由后背引出，无菌包扎。损伤后2 h开始刺激，刺激电压为 4 V，波宽 0.21 ms，频率 15 Hz，刺激时间 10 s，间歇时间20 s。每次刺激10 min，休息10 min，共持续2 h。每天 8∶00-10∶00，18∶00-20∶00刺激两次［2］。

1.4 示踪菌定植

按照50μg／ml的浓度加入zeocin抗生素于无菌蒸馏水中，给予大鼠连续饮用7 d，在大鼠饮用加入zeocin抗生素无菌蒸馏水的第4、5天按 10 ml／kg，1次／天给大鼠灌入pSELECT-GFPzeo-mcs质粒转染的大肠杆菌菌液，灌胃前灌饲1.5%1 ml碳酸氢钠溶液。在大鼠饮用加入zeocin抗生素无菌蒸馏水的第5、6、7天连续3 d采集粪便标本于LB带抗生素培养皿中进行培养，荧光显微镜下鉴别细菌。

1.5 组织学观察

取小肠，用4%甲醛液固定，经梯度乙醇系列脱水，二甲苯透明后，常规石蜡包埋，HE染色，光学显微镜观察记录。

1.6 透射电镜

取面积为1 mm×1 mm的小肠组织放入4%戊二醛固定；0.1 mol／L PBS漂洗两次；1%锇酸固定2 h；丙酮梯度脱水；环氧树脂618包埋；半薄切片定位；超薄切片，铀染，铅染；透射电镜观察。

1.7 内毒素测定

用无热源注射器抽取大鼠肝门静脉血适量，取掉针头贴壁注入无热源管中；静置30 min，离心5 min（3 500 r／min）；取血清 0.1 ml，加入鲎试剂盒中的试验用水0.9 ml，混匀后置75℃水浴加热10 min，冷却至室温备用；利用鲎试剂盒（广州安度斯生物有限公司产品）定量测定血清内毒素。

1.8 细菌培养

无菌条件下采取大鼠小块肝脏和脾脏及肠系膜淋巴结各0.2 g并分别研碎；将研碎组织放入装有无菌1 ml生理盐水的离心管中混匀；取0.2 ml混匀后组织均匀涂抹于LB培养基上，24 h（37℃）培养后观察菌落形态、数量；荧光显微镜下观察，鉴定细菌。

1.9 免疫组化检测

常规脱蜡和水化；3%H2O2滴加在石蜡切片组织上，室温静置10 min，PBS洗5 min×3次；抗原修复：将 0.01 mol／L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）放置于微波炉里加热至沸腾后将石蜡切片放入，断电，间隔5～10 min，反复1～2次，冷却至室温，PBS洗5 min×3次；滴加5%BSA封闭液，放入湿盒后，将湿盒置于37℃恒温箱中20 min；甩去5%BSA封闭液滴加Ι抗50μl，4℃过夜；4℃过夜后，放置于37℃恒温箱中复温45 min，PBS洗5 min×3次；滴加Ⅱ抗45～50 μl，放置于37℃恒温箱中1 h，PBS洗5 min×3次；DAB显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗10 min；苏木精复染2 min，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片、镜检。

1.10 Western blot方法检测组织中ZO-1蛋白含量

向2 ml离心管中加入1 ml PMSF和10μl RIPA充分混匀，用干净的剪刀将0.2 g小肠组织块剪碎后加入到离心管中，使用组织匀浆器匀浆，匀浆后放置冰上裂解30 min；离心取蛋白沉淀；Lowry法测蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳后，蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭PVDF 2 h，洗膜后加入ZO-1一抗，4℃反应过夜，次日洗膜，随后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温反应1 h。洗膜，加入 ECL显色剂，X片显影。以β-actin为内参。用 image J图象分析软件，根据光密度定量分析。

1.11 统计处理

应用SPSS13.0统计软件，两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析，不同率之间的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 一般情况

SCI后立即出现尿潴留，随着时间的推移，腹胀进行性加重，剖腹观察小肠肠管胀气明显，肠壁透光性增强；盲肠、结肠和直肠大量粪便堆积，触之较硬结，远端肠道蠕动明显减弱；ES大鼠，一般情况及剖腹后观察，肠道功能改善明显（图1，见彩图页Ⅳ）。

2.2 肠道形态学观察

2.2.1 光镜：N组小肠黏膜保持完整，肠绒毛形态正常；SCI组24 h：黏膜下血管充血，炎性细胞浸润。48 h：黏膜下血管充血，大量炎性细胞浸润，少量渗出物。72 h：黏膜下水肿、淤血，大量炎性细胞浸润，肠绒毛破坏，上皮细胞坏死、大量渗出。ES组24 h：黏膜下血管轻微充血，少量炎性细胞浸润。48 h：黏膜下血管轻度充血，少量渗出物，少量炎性细胞浸润。72 h：黏膜下血管轻度充血，少量渗出物，少量炎性细胞浸润（图2，见彩图页Ⅳ）。

2.2.2 电镜：N组可见两个吸收细胞之间正常的紧密连接、中间连接和桥粒，小肠微绒毛排列整齐；SCI组24 h：黏膜上皮细胞轻度水肿，细胞间隙略增宽。48 h：黏膜上皮细胞水肿严重，细胞间隙明显增宽。72 h：黏膜上皮细胞水肿严重，部分细胞坏死，细胞间隙明显增宽，微绒毛水肿、折断并脱落。ES组24 h：黏膜上皮细胞轻度水肿，细胞间隙无增宽。48 h：黏膜上皮细胞轻度水肿，细胞间隙略增宽。72 h：黏膜上皮细胞水肿，细胞间隙略增宽，微绒毛变疏松（图3，见彩图页Ⅳ）。

2.3 内毒素结果

SCI组和ES组不同时间段与正常组差异均有统计学意义（P＜0.01）；ES组与 SCI组不同时间段之间的差异均有统计学意义，（P＜0.01，表1）。

2.4 各器官细菌培养

肝脏：实验组与对照组48 h细菌培养阳性率差异有显著性（P＜0.05），24、72 h及总数差异有显著性（P＜0.01）；淋巴结：实验组与对照组 24、72 h细菌培养阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），48 h及总数差异有统计学意义（P＜0.01）；脾脏：实验组与对照组48 h细菌培养阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），24、72 h及总数差异有统计学意义（P＜0.01，表 2）。

2.5 肠组织ZO-1表达

各组大鼠肠道组织提取蛋白后，经Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1的变化趋势，结果证实，各组ZO-1蛋白水平的表达无统计学差异（P＞0.05）。各组大鼠肠道石蜡包埋切片后，经免疫组化观察紧密连接蛋白ZO-1的分布，发现随着时间的推移对照组ZO-1的分布出现不同程度的排列散乱、不规则，实验组ZO-1的分布得到不同程度的改善（图4、表3、图 5，图 5见彩图页Ⅳ）。¯

Tab.1 Endotoxin levels in blood serum（U／ml，，n＝10）

Tab.1 Endotoxin levels in blood serum（U／ml，，n＝10）

N：Normal group；SCI：Spinal cord injury；ES：Electrie Stiwulation**P＜0.01 vs N；＃＃P＜0.01 vs SCI

Group 24 h 48 h 72 h N 0.698±0.043 — —SCI 4.114±1.055** 6.936±1.497** 8.702±1.666**ES 2.583±0.262**＃＃ 1.156±0.299**＃＃ 0.925±0.145**＃＃

Tab.2 Bacterial translocation in differeft organs（，n＝8）

Tab.2 Bacterial translocation in differeft organs（，n＝8）

ES：Electrie stimulation；SCI：Spinal cord injury*P＜0.05，**P＜0.01 vs ES

Group Lymph Nodes Liver Spleen 24 h 48 h 72 h Total ES 50% 38% 50% 46% 38%25% 0 21% 13% 13% 25%17%SCI 100%*100%**100%*100%**100%**88%*100%**96%**88%**75%*100%**88%24 h 48 h 72 h Total 24 h 48 h 72 h Total**

Tab.3 ZO-1 Western blot quantitative analysis（x±s）

3 讨论

完整的肠道功能为机体提供屏障保护，防止肠道内微生物移位和内毒素吸收，主要包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以机械屏障最为重要。机械屏障的结构基础为黏液层、完整的肠粘膜上皮细胞和上皮细胞间的紧密连接［3］。粘液层能够阻止大颗粒物质包括大部分的细菌与肠道上皮细胞的直接接触［4］。完整的肠上皮细胞选择通透性能够有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜组织进入血液［5］。肠上皮细胞间通道是封闭的，这种生理功能是由相邻上皮细胞之间的连接复合体完成的，其中紧密连接起着主要的作用。紧密连接是由多种跨膜蛋白、膜蛋白以及调节分子所构成，跨膜蛋白调节着紧密连接的通透性，其最重要的蛋白为封闭蛋白家族，ZO-1作为其中的关键蛋白在紧密连接各蛋白的组装和维护方面起着至关重要的作用［6］。肠道的蠕动是肠道机械屏障的另一重要组成部分［7］。正常的肠道菌群构成肠道里的非特异性免疫屏障，当肠道细菌的数量、种类或者位置发生变化时，肠道的稳态发生破坏，肠道的机械屏障就会遭到破坏，从而使肠道的通透性增加［8］。SCI时可直接或间接破坏肠道粘液层、肠道上皮细胞、细胞间的紧密连接、破坏正常的肠道菌群的平衡以及造成肠道蠕动的紊乱，造成肠机械屏障的破坏。

如何防治SCI后肠道功能障碍及相关并发症方法很多，但都不是很理想。随着SNS的出现，给我们带来了希望。大多数SCI患者出现长期的腹胀、腹痛及发热等表现，有的甚至出现全身炎症反应综合症、脓毒血症、败血症甚至感染性休克等严重并发症。因此，早期解决排便问题、恢复肠道功能尤为关键。骶副交感中枢对结肠动力起着重要的调节作用，特别是在排便时，肛门括约肌主要由骶髓发出的阴部神经支配（S2-S4）［9］。研究表明，S3对结肠及直肠运动功能起着主要的支配作用并且对肛门外括约肌支配功能的影响也最为显著。刺激停止后，立即舒张，而直肠则缓慢松弛，引起自发性排便，电刺激S3还可以诱导全结肠产生顺行压力波，促进肠道蠕动，加快排便频率及数量［10］。因此本实验观察了SNS对SCI后肠道动能的改善情况，尤其是对机械屏障的改善情况发现：SNS确实能够增强肠道的蠕动，能较好的改善肠道功能，排出肠内容物，使肠道菌群数量减少，上皮细胞、肠绒毛以及紧密连接破环得到不同程度的改善，血清内毒素水平下降和细菌移位发生减少。SNS模拟肠道生理机制，以纯物理的方法持续、可控的恢复肠道功能，从而改善生活质量，同时预防肠道细菌移位和内毒素血症，减少病死率，具有较好的应用价值及社会效益。但SNS是否对肠道神经系统及免疫屏障等有改善作用，还需要下一步继续研究。

总之，电刺激S3神经根能较好促进肠道蠕动，保护肠黏膜机械屏障，改善肠黏膜屏障功能，进而减轻内毒素血症和肠道细菌移位，为临床预防脊髓损伤截瘫后内毒素血症和肠道菌群移位感染的发生、减少全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭的风险提供了一种有效的选择。

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