上调血红素氧合酶1对糖尿病心肌梗死大鼠心功能的远期影响*

李 健，陈天萌，曹 剑△，陈德友，王 浩，石海燕，高 萌，范 利，Abraham Nader G

（1.中国人民解放军总医院南楼心血管一科，北京100853；2.美国马修大学琼C爱德华医学院，西弗吉尼亚州257001）

急性心肌梗死／急性心力衰竭为临床最常见的心血管急症，是各级医院心血管死亡的重要原因之一。此死亡率与年龄增长正相关，年龄率越大，死亡率越高，罹患糖尿病患者心力衰竭的发生更高，并且糖尿病患者在出现一次心肌缺血事件后，近期心血管不良事件相关疾病的发病率和死亡率均显著升高。

血红素氧合酶（heme oxygenase，HO）有三种异构体，其血红素氧合酶-1（HO-1）为诱导型，其酶活性在金属、血红素和激素等许多因子的诱导下可提高上百倍。其可通过降解血红素并生成具有抗炎、抗凋亡作用的胆绿素／胆红素。胆红素有保护内皮细胞完整性，防止动脉粥样硬化斑块形成，增强血管反应性，抑制血管成形术后再狭窄，减少氧化应激等多种作用。本研究初步探讨上调HO-1对糖尿病心肌梗死大鼠模型的心力衰竭发生发展的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，体重300～400 g，由解放军总医院动物试验中心提供，普通喂养。

1.2 方法

在所有大鼠进行基线血糖和心脏超声测定后，随机分为5组（n＝12）。分别为：假手术组：Wistar大鼠行假手术（shan组）；糖尿病组：对已建立糖尿病模型的Wistar大鼠行假手术（DM＋sham组）；模型组：对已建立糖尿病模型的Wistar大鼠行心肌梗死模型的建立，给予生理盐水（DM＋MI）；诱导剂组：对已建立糖尿病模型的Wistar大鼠行心肌梗死模型的建立，给予诱导剂钴原卟啉（DM＋MI＋CoPP）；抑制剂组：对已建立糖尿病模型的Wistar大鼠行心肌梗死模型的建立，给予抑制剂钴原卟啉＋锡中卟啉（DM＋MI＋CoPP＋SnMP）于心梗造模术后第一天开始给药：钴原卟啉（cobalt original porphyrin，CoPP）4.5 mg／kg，1次／周，锡中卟啉（tin porphyrin，SnMP）15 mg／kg，1次／周，持续6周，腹腔注射。术后28周末，进行心脏超声、血流动力学、血清指标和Western的检测。

1.3 糖尿病模型的建立

大鼠禁食10 h后，40 mg／kg尾静脉一次性注射链脲霉素溶液，24 h后血糖平均值达（28.7±1.7）mmol／L，稳定3 d。同时为了避免极度高血糖，并保持正常体重，每周使用3次胰岛素（鱼精蛋白胰岛素每只按100 g体重给予1～3 U／d），保持血糖水平在25～28 mmol／L，实验中通过毛细管从尾静脉取血来测定血糖。

1.4 心肌梗死模型的建立

在呼吸机辅助通气下，左侧平2～3肋间处开胸，于左心耳与肺动脉圆锥交界处下方2 mm处结扎前降支。当近心尖的左室前壁变为暗灰色，收缩力降低或消失；心电图出现ST段弓背向上抬高及Q波，证明心肌梗死模型建立成功。假手术组开胸、穿线，但不结扎。

1.5 大鼠心功能及心室重构指标的检测

麻醉并固定后，用美国Acuson Sequoia 512型超声诊断仪（探头频率10 MHz）于胸骨旁左心室短轴平乳头及水平采集左心室图像，测量左心室压力最大上升速率（the maximal rise of ventricular pressure over time，＋dp／dtmax），左心室压力最大下降速率（the maximal decrease of ventricular pressure over time，-dp／dtmax），左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular shortening fraction，LVFS），左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD），左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）。

1.6 血指标的检测

心功能检测后，于右颈动脉插管处放血，分离血清，-80℃保存，测定血糖（blood glous，GLU）、总胆红素（total bilirubin，TB）、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）、血清肌酐（serum creatinine，Cr）、谷氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等指标，采用 ELISA测定肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列环素（prostacyclin，PGI）、超敏 CRP（hypersensitive C reactive protein，HsCRP）等水平。

1.7 Western blot检测

心脏组织剪碎分装于1.5 ml离心管中，-80℃冰箱中保存。行Western检测时，依据蛋白定量结果将上样量调至一致，经电泳、转膜、加一抗、洗膜、加二抗、显色等步骤，测定心肌组织中血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、血红素氧合酶 2（heme oxygenase-2，HO-2）、磷酸化的内皮型一氧化氮合酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthasee，peNOS）、活化 蛋白激 酶 （activated protein kinase，AKT）、磷酸化的活化蛋白激酶、（phosphorylated activated protein kinase，pAKT）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化的腺苷活化的蛋白激酶（phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase，pAMPK）的表达。Western图像分析采用 Image J软件进行处理。

1.8 统计学方法

应用SPSS 15.0统计软件，各组数据均以均数±标准差（）表示，多组间比较采用 ANVOA方差分析。

2 结果

2.1 术后28周心功能及心室重构指标的比较

与模型组相比，诱导剂组的 ＋dp／dtmax、-dp／dtmax、LVEF、左心室短轴缩短率（LVFS）均升高（P＜0.05，P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组的 ＋dp／dtmax、-dp／dtmax、LVEDD、LVEF、LVFS均降低（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.2 术后28周血清葡萄糖水平的比较

与假手术组相比，其余各组血糖均明显升高（P＜0.01），糖尿病鼠心肌梗死后较糖尿病假手术组血糖明显升高（P＜0.01），而在糖尿病心肌梗死鼠中使用诱导剂后，血糖有所下降（P＜0.05），抑制剂组血糖较诱导剂组血糖明显升高（P＜0.05，表2）。

2.3 术后28周血清胆红素水平的比较

与假手术组相比，糖尿病组胆红素水平有所升高（P＜0.05），糖尿病鼠心肌梗死后胆红素水平有所下降（P＜0.05）。诱导剂组的血清胆红素水平明显升高（P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组的血清胆红素水平降低（P＜0.01，表 2）。

2.4 术后28周肝肾功能的比较

5组大鼠的血清肌酐、血清谷氨酸转氨酶均无统计学差异（表2）。

2.5 术后28周血清炎性指标的比较

与模型组相比，诱导剂组的血清超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子α的水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组的血清超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子α的水平升高（P＜0.01，表3）。

2.6 术后28周血清内皮功能指标的变化

与模型组相比，诱导剂组的血清一氧化氮、前列环素的水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组的血清一氧化氮、前列环素的水平降低（P＜0.01，表 3）。

2.7 术后28周大鼠心肌组织中血红素氧合酶表达水平的变化

与模型组相比，诱导剂组心肌组织中HO-1表达水平升高（P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组心肌组织中HO-1表达水平降低（P＜0.05，图1，表4）。HO-2表达无统计学差异。

Tab.1 Comparisons of cardiac function at the 28th week post operation（，n＝12）

Tab.1 Comparisons of cardiac function at the 28th week post operation（，n＝12）

Sham：Sham operation group；DM ＋sham：Diabetes＋sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；DM ＋MI＋CoPP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋tin porphyrin group；＋dp／dtmax：Maximal rise of ventricular pressure over time；-dp／dtmax：Maximal decrease of ventricular pressure over time；LVEDD：Left ventricular end-diastolic diameter；LVESD：Left ventricular end-systolic diameter；LVEF：Left ventricular ejection fraction；LVFS：Left ventricular shortening fraction*P＜0.05，**P＜0.01 vs Dm＋sham；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Dm＋sham＋CoPP

Group ＋dp／dtmax（mmHg／s）-dp／dtmax（mmHg／s）LVEDD（mm）LVESD（mm）LVEF（%）LVFS（%）?Sham 855.11±10.95-7665.7 ±2.47 6.61±0.12 3.70±0.11 77.3±2.1 47.3±2.1 Dm＋sham 1589.09±8.89-1444.62±17.76 6.77±0.15 3.80±0.20 76.0±4.0 46.0±3.6 Dm＋MI 835.66±129.48-784.37±35.69 5.63±0.55 4.43±0.45 42.7±8.0 18.0±3.6 Dm＋MI＋CoPP 1345.85±155.99*-1343.03±196.27*6.03±0.38 4.17±0.06 53.7±4.2*28.3±3.5**Dm＋MI＋CoPP＋SnMP 946.76±53.89＃ -999.51±29.02＃ 4.27±0.25＃＃ 3.87±0.06＃ 37.7±8.5＃ 16.7±5.1＃＃

Tab.2 Comparisons of serologic indices at the 28th week post operation（，n＝12）

Tab.2 Comparisons of serologic indices at the 28th week post operation（，n＝12）

Sham：Sham operation group；DM ＋sham：Diabetes＋sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；DM ＋MI＋CoPP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋ tin porphyrin group；GLU：Blood glucose；TB：Total bilirubin；Cr：Serum creatinine；ALT：Alanine aminotransferase*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Dm＋MI；△△P＜0.01 vs Dm＋MI＋CoPP

Group GLU（mmol／L） TB（μmol／L） Cr（μmol／L） ALT（U／L）Sham 6.69±0.45 0.55±0.05 33.00±2.65 38.00±6.00 Dm＋sham 21.07±6.91** 1.12±0.19* 30.50±12.61 69.00±21.24 Dm＋MI 33.89±3.43 0.67±0.29* 25.00±2.92 73.00±20.72 Dm＋MI＋CoPP 25.99±1.50* 1.57±0.18＃＃ 25.40±2.79 56.60±43.13 Dm＋MI＋CoPP＋SnMP 27.17±3.54＃ 0.32±0.17△△24.00±2.83 86.00±7.07

Tab.3 Comparisons of inflammatory biomarkers and endothelial function indices at the 28th week post operation（，n＝12）

Tab.3 Comparisons of inflammatory biomarkers and endothelial function indices at the 28th week post operation（，n＝12）

Sham：Sham operation group；DM ＋sham：Diabetes＋sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；DM ＋MI＋CoPP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋tinporphyrin group；Hs-CRP：Hypersensitive Creactive protein；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；NO：Nitric oxide；PGI2：Prostacyclin 2*P＜0.05，**P＜0.01 vs Dm＋MI；＃＃P＜0.01 vs Dm＋MI＋CoPP

Group Hs-CRP（ug／ml） TNF-α（pg／ml） NO（μmol／L） PGI2（ng／ml ）Sham 153.95±44.61 143.80±30.67 21.56±0.99 2.75±0.36 Dm＋sham 126.50±30.62 271.07±29.01 33.88±8.31 2.51±0.59 Dm＋MI 196.25±122.92 269.73±34.25 31.16±4.17 4.79±0.90 Dm＋MI＋CoPP 86.83±7.88* 131.46±23.35** 47.61±9.41** 8.05±0.69**Dm＋MI＋CoPP＋SnMP 128.48±44.94＃＃ 341.80±32.16＃＃ 23.69±2.29＃＃ 2.06±1.38＃＃

Fig.1 Expression of heme oxygenase at 28 weeks post operation DM ＋sham：Diabetes＋sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；Sham：Sham operation group；DM ＋MI＋CoPP：diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋tin porphyrin group；HO：Heme oxygenase

Tab.4 Comparison of heme oxygenase expression at the28th week post operation（，n＝12）

Tab.4 Comparison of heme oxygenase expression at the28th week post operation（，n＝12）

Sham：Sham operation group；DM ＋sham：Diabetes＋sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；DM ＋MI＋CoPP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋tin porphyrin group；HO：Heme oxygenase**P＜0.01 vs Dm＋MI；＃P＜0.05 vs Dm＋MI＋CoPP

1.96±0.29 Group HO-1／tublin HO-2／tublin Sham 2.22±0.36 1.92±0.18 Dm＋sham 1.58±0.51 2.16±0.30 Dm＋MI 1.63±0.42 1.84±0.19 Dm＋MI＋CoPP 4.45±0.75** 2.03±0.21 Dm＋MI＋CoPP＋SnMP 3.95±0.43＃

2.8 术后28周大鼠心肌组织中信号通路分子表达水平的变化

与模型组相比，诱导剂组心肌组织中 peNOS、pAkt、pAMPK表达水平升高（P＜0.01）。与诱导剂组相比，抑制剂组心肌组织中 peNOS、pAkt、pAMPK表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01，图 2、表 5）。

3 讨论

本研究显示，在糖尿病心肌梗死大鼠模型上短期应用钴原卟啉上调HO-1，能够长期地提高模型鼠血清胆红素水平，抑制过度的炎症反应，修复内皮功能和心功能，从而有效地改善模型鼠的远期预后（本研究观察期28周，相当于大鼠正常生存期的1／3）。而各组大鼠的血清肌酐、血清谷氨酸氨基转移酶无统计学差异提示了本实验采用药物剂量是安全的，进一步说明本研究中血清胆红素的升高并不是由于肝功能的异常变化引起的。

一氧化氮（NO）是最重要的内皮信号分子之一。由血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）以左旋精氨酸为底物，生成左旋胍氨酸和NO。NO通过扩散方式至血管内皮细胞，激活鸟甘酸环化酶（GC），促进GTP转化成 cGMP，后者作用于钙调蛋白，使血管扩张。NO的功能包括调节血管张力扩张血管，还有抑制血管平滑肌细胞增殖迁移、白细胞粘附和血小板聚集，维持内皮功能稳定等作用［1］。

Fig.2 Protein expression of peNOS，pAMPK signaling pathway members in cardiac muscle at the 28th week post operation

前列环素（PGI2）产生于血管壁，尤其是内皮细胞。是环氧合酶-2分解花生四烯酸的主要产物。它通过激活腺苷酸环化酶（AC），使多种细胞中的cAMP升高。在生理上与血栓烷A2形成拮抗，与eNOS／NO／GC／cGMP系统有着协同作用。PGI2的作用包括使血管扩张、抑制血小板的聚集，并抑制动脉粥样硬化的形成、血栓栓塞、心肌肥大及纤维化、缺血再灌注损伤及血管重塑［2］。在本研究中，与对照组大鼠相比，糖尿病心梗大鼠NO、PGI2水平较低；应用HO-1诱导剂可以上调糖尿病心梗大鼠的NO、PGI2水平，改善内皮功能，有助于缩小梗死面积和改善心功能。

Tab.5 Protein expression of peNOS，pAMPK signaling pathway members in cardiac muscle at the 28th week post operation（，n＝12）

Tab.5 Protein expression of peNOS，pAMPK signaling pathway members in cardiac muscle at the 28th week post operation（，n＝12）

Sham：Sham operation group；DM ＋MI：Diabetes＋MI group；DM＋MI＋CoPP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group；DM＋MI＋CoPP＋SnMP：Diabetes＋myocardial infarction＋cobalt original porphyrin group＋tin porphyrin group；peNOS：Phosphorylated endothelial nitric oxide synthase；pAkt：Phosphorylated activated protein kinase；pAMPK：Phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase；Akt：Activated protein kinase；AMPK：Adenosine monophosphate-activated protein kinase**P＜0.01 vs Dm＋MI；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Dm＋MI＋CoPP

Group peNOS／actin pAkt／actin pAkt／Akt pAMPK／actin pAMPK／AMPK Sham 0.33±0.07 1.75±0.27 1.65±0.14 1.88±0.46 1.33±0.21 Dm＋MI 0.38±0.08 1.11±0.32 0.55±0.07 0.99±0.32** 0.45±0.19 Dm＋MI＋CoPP 0.57±0.15** 1.15±0.43** 0.63±0.09** 1.18±0.27** 0.63±0.04**Dm＋MI＋CoPP＋SnMP 0.40±0.06＃ 0.84±0.14＃ 0.38±0.10＃＃ 1.06±0.36＃ 0.37±0.13＃＃

催化NO生成的关键酶是一氧化氮合酶（NOS）。NOS有三种同工酶：内皮型（eNOS）、诱导型（iNOS）、神经型（nNOS）。其中eNOS是构成酶，分布于内皮系统中，正常生理状态下即表达，主要负责基础NO的合成和各项生理功能［3］。eNOS是膜结合型的，当与Ca2＋结合的钙调蛋白作用于eNOS，eNOS解离进入细胞浆，通过与热休克蛋白（HSP90）、Akt相互作用进一步被激活，合成eNOS源性NO，作用于sGC启动PKG通路，发挥下游调节作用［4］。在心衰的心肌中，eNOS与多种受体形成复合体，通过对β肾上腺素受体的抑制作用抑制心室重塑，改善心肌收缩功能［5］。

腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPK）是一种重要的蛋白激酶，参与调节机体的能量代谢，在糖代谢、脂代谢、维持胰岛β细胞功能上有重要作用。也是调控NOS表达的上游调节因子。内皮中的AMPK通过磷酸化eNOS的1177位点上的丝氨酸激活eNOS，增强内皮依赖性的血管舒张，并通过抑制iNOS抑制过度的炎症反应。此外激活的AMPK，还可以通过抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应，促进游离脂肪酸的氧化，对心血管系统也有一定的保护作用［6］。Akt又称为蛋白激酶B，由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）激活后，主要通过对含有丝氨酸／苏氨酸残疾的底物进行磷酸化而发挥作用，与抗凋亡促进细胞生存有密切联系。Akt也是eNOS上游的调控因子，可以激活eNOS促进NO合成，并发挥其相应的生物学效应［7］。

糖尿病能够导致内皮功能紊乱，高血糖和大量的游离脂肪酸能够通过炎症反应、氧化应激降低NO的活性，造成血管舒张功能减弱和血管内皮细胞损伤。在糖尿病模型的心脏中存在着进行性eNOS表达的下降和iNOS表达的上升［8］。本实验证明，对糖尿病心肌梗死模型应用钴原卟啉能够抑制其iNOS的过表达，促进eNOS的表达及磷酸化，并促进NOS上游调控因子AMPK、Akt的表达，恢复两种异构体表达的平衡，提高心脏和血管的功能。

氧化应激和炎症反应被认为是动脉粥样硬化发病学的主要因素，与代谢综合征有着密切的关系。CRP是一种急性期反应蛋白，是糖尿病心血管事件的独立预测因子，是2型糖尿病血管炎性反应的一个重要标记物。超敏C反应蛋白（hs-CRP）对糖尿病心血管并发症的危险性分析更为敏感。临床研究显示，hs-CRP与糖尿病前状态（糖化血红蛋白5.7～6.4%，空腹血糖 5.6～6.9 mmol／L）发生的危险性呈独立正相关［9］。基线年龄、hs-CRP、脂联素水平是预示血糖恶化的独立危险因素［10］。本研究显示上调HO-1能有效降低糖尿病心肌梗死大鼠的血清hs-CRP水平，一方面反映了HO-1的抗炎作用，另一方面也提示了上调HO-1对改善糖尿病心肌梗死患者的远期预后上的潜在价值。

综上所述，HO-1能够降低糖尿病合并心肌梗死大鼠模型的血糖水平，抑制炎症反应和内皮功能紊乱，改善梗死后心功能。有望成为一种针对糖尿病心肌梗死后保护心功能、降低病死率的有效、经济的治疗手段。

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