清营泻瘀方联合力肽对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障的保护作用

陈 江，方孙阳，吴志明

浙江绍兴医院普外科（绍兴312030）

我们在临床实践发现，肠缺血再灌注损伤急性期以热邪和毒邪为主，表现为热毒炽盛，采用清营泻瘀方，清热解毒，凉血泻瘀，临床应用效果显著。前期实验发现[1]，清营泻瘀方与大承气方相比，其对肠缺血再灌注损伤大鼠肠屏障有显著的保护作用。本实验以此为基点，研究清营泻瘀方联合力肽对肠缺血再灌注大鼠肠屏障的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠72只，体质量（280±10）g，清洁级。浙江大学医学院实验动物公司提供。清洁级动物房饲养，20～24℃，自由饮水，普通饲料喂养。

1.2 药物 戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。中药清营泻淤方：水牛角片30 g，益母草30 g，生大黄15 g（后下），芒硝12 g，党参15 g，甘草10 g。中药大承气方：生大黄12 g（后下），厚朴24 g，枳实12 g，芒硝6 g（冲）。采用配方颗粒制成浓度为1∶1药液(含生药1 g/mL)，灭菌处理后4℃冰箱内保存。配方颗粒剂由江苏天阴药业有限公司提供。力肽由无锡华瑞制药有限公司提供。

1.3 主要试剂及仪器 TNF-α和IL-10的试剂盒分由美国Biosouce International Inc和R＆D Systems Inc公司提供。D-乳酸试剂盒为美国Synthecon公司产品，D-乳酸脱氢酶(D-LDH)购于美国Sigma公司。芬兰Labsystems Dragon Wellscan MK2型酶标仪。

1.4 动物模型的制备 1%戊巴比妥钠(100 mg/kg)腹腔内注射麻醉。上腹部正中切口（长约2 cm）入腹，分离肠系膜上动脉及其周围组织，在肠系膜上动脉根部用动脉夹钳夹，观察2 min。待确定肠系膜上动脉血流被阻断（肠壁苍白，血管无搏动），缝合伤口。45 min后开腹，打开动脉夹，恢复肠系膜上动脉血液供应（肠壁变红，血管搏动），再关腹。整个手术过程中，腹腔内滴加37℃生理盐水5 mL，保持血流动力学的稳定，并注意保暖。

1.5 动物分组及给药方法 将72只大鼠随机分为假手术组8只、模型组、中药组（清营泻瘀方）、西药组(力肽)、合用组(清营泻瘀方联合力肽)各16只，后四组按造模后处死时间再分别分为再灌注后2 h组和再灌注后24 h组（每组8只）。术前2 d分别给予生理盐水、清营泻瘀方和力肽灌胃（2.2 mL/只/d），最后1 d灌胃在术前30 min。按组别分于再灌注后2 h和24 h处死，取末端回肠组织作病理切片；所采血样3000 r，离心20 min，分离血清和血浆，置-70℃超低温冰箱中保存。

1.6 检测指标及其方法 组织病理学:将回肠末端组织固定于中性福尔马林溶液中，常规脱水，石蜡包埋，切片HE染色后光镜下观察组织学变化。血清中TNF-α和IL-10的测定采用酶标仪进行测定，按照试剂盒使用说明所规定的操作规程和结果判定方法进行。血浆D-乳酸采用改良的酶学分光光度法检测。将血浆加入试管，与含4.6 mmol/L NAD+的碳酸盐缓冲液混合。待测管加入50μL D-乳酸脱氢酶，空白管加入50μL蒸馏水，以空白管调零于340 nm处测定吸光度。

1.7 统计学分析 所有数据均采用SPSS 14.0统计软件进行分析。计量资料以以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠黏膜组织形态学观察 肠黏膜病理采用Chiu评分，评分标准见表1，结果见表2。光镜下，假手术组回肠黏膜形态结构无明显变化（图1）；模型组肠I/R后2 h后呈急性炎症改变：黏膜和黏膜下层充血、水肿和糜烂，固有层有多量中性粒细胞浸润，部分可见黏膜上皮坏死脱落（图2）；中药组和西药组亦可见上述表现，但损伤程度较模型组明显减轻（P＜0.01），合用组优于中药组（P＜0.05）（图3～图5）。肠I/R后24 h，各组肠黏膜结构基本修复，治疗组与模型组无明显差别（P＞0.05）。

表1 肠黏膜损伤评分标准

表2 各组间大鼠肠黏膜Chiu评分（±s）

表2 各组间大鼠肠黏膜Chiu评分（±s）

注：与假手术组比较，a P＜0.05，aa P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.05，bb P＜0.01；与西药组比较，c P＜0.05，cc P＜0.01与中药组比较，d P＜0.05，dd P＜0.01

组别假手术组模型组西药组中药组合用组n8 8 8 8 8再灌注2 h 0.63±0.52bb、cc、dd 4.13±0.83aa、cc、dd 3.25±0.46aa、bb、dd 2.38±0.52aa、bb、cc 1.63±0.52aa、bb、cc、d再灌注24 h 0.63±0.52bb、cc、dd 2.13±0.64aa 2.00±0.76aa 1.75±0.71aa 1.50±0.53a

2.2 血清TNF-α和IL-10含量变化 肠I/R后2 h，与假手术组相比，模型组血清中TNF-α水平明显升高（P＜0.01）；中药组和合用组TNF-α水平均较模型组明显降低（P＜0.01）；IL-10的表达在各组间无差别。肠I/R后24 h，与假手术组相比，模型组血清中TNF-α和IL-10水平均明显升高（P＜0.01）；中药组和合用组TNF-α水平较模型组降低；中药组和合用组IL-10水平均较模型组明显降低（P＜0.01）见表3。

图1 假手术组(HE,×40)

图2 模型组肠I/R后2 h(HE,×40)

图3 中药组肠I/R后2 h(HE,×40)

图4 西药组肠I/R后2 h(HE,×40)

图5 合用组肠I/R后2 h(HE,×40)

2.3 血浆中D－乳酸含量的变化 肠I/R后2 h，与假手术组相比，模型组血浆中D-乳酸水平明显升高（P＜0.01）；中药和西药组D-乳酸水平较模型组均明显降低（P＜0.01），中药组优于西药组（P＜0.05）.肠I/R后24 h，与假手术组相比，模型组血浆中D-乳酸水平明显升高（P＜0.01）；中药组D-乳酸水平较模型组降低（P＜0.05）见表4。

3 讨论

中医认为，邪和瘀是诸血管病发生的主要原因，以邪为主因，由邪（致病因子）致瘀（血栓），继而伤正（缺血或郁血）。因此，邪盛致生新瘀则病急，邪祛但留旧瘀则病缓。尽管活血化瘀类中药如丹参等具有改善腹腔脏器的血液循环，防止血栓形成的作用，但是仅适用于慢性缺血阶段，如果不择时机，不辨病邪的全程重用，反可使疗效降低，病程延长。我们在临床实践发现，肠缺血再灌注损伤急性期以热邪和毒邪为主，表现为热毒炽盛，灼伤营血而生瘀，治疗上以清热解毒，凉血泻瘀为主，疗效显著。

表3 各组间大鼠血清TNF-α和IL-10含量比较（±s D，pg/mL）

表3 各组间大鼠血清TNF-α和IL-10含量比较（±s D，pg/mL）

注：与假手术组比较，aa P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.05，bb P＜0.01；与西药组比较，c P＜0.05，cc P＜0.01；与中药组比较，d P＜0.05，dd P＜0.01

组别假手术组模型组西药组中药组合用组n 8 8 8 8 8 TNF-α IL-10再灌注2 h 90.77±4.41bb、dd 143.21±18.19aa、dd 115.86±18.27 104.17±6.40aa、bb 92.41±18.35bb再灌注24 h 90.77±4.41bb、dd 114.88±13.73aa、d 110.64±8.93aa 102.83±13.90b 94.16±10.60bb、cc再灌注2 h 16.14±4.22 19.93±6.40 16.46±4.89 17.35±2.89 16.29±4.67再灌注24 h 16.14±4.22bb、cc 49.04±13.17aa、c、dd 37.57±13.61aa、b、dd 22.83±8.31bb、cc 21.87±6.51bb、cc

表4 各组间大鼠血浆中D乳酸含量的比较（±s D：mg/L）

表4 各组间大鼠血浆中D乳酸含量的比较（±s D：mg/L）

注：与假手术组比较，aa P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.05，bb P＜0.01；与西药组比较，c P＜0.05，cc P＜0.01；与中药组比较，d P＜0.05，dd P＜0.01

组别假手术组模型组西药组中药组合用组n8 8 8 8 8再灌注2 h 3.60±0.69bb、cc、dd 14.13±2.09aa、cc、dd 11.84±1.42aa、bb、d 10.38±1.41aa、bb、c 8.69±0.92aa、bb、cc、d再灌注24 h 3.60±0.69bb、cc、dd 9.93±1.03aa、c、dd 8.94±0.74aa、b 8.54±0.54aa、bb 7.49±0.67aa、bb、cc、dd

清营泻瘀方是上海市名老中医奚九一教授的临床经验方剂，重用益母草、水牛角片作为清热凉血解毒之主药，具有清热解毒、凉血行瘀、利水消肿的功效。此外根据“六腑以通为用”，“胃气以降为顺”的原则，还着重使用了通腑泻下类药物大黄和芒硝，荡涤肠胃宿垢、致病菌和毒素，消除肠道麻痹造成的肠道瘀滞状态，使病人在最短的时间内排便、排气，减少肠道有害物质的吸收，减少肠道细菌移位。同时能够通过调节前列腺素I2(PGI2)与血栓素B2(TXB2)之间的平衡，保证组织器官的微循环，改善肠道组织血液灌流，降低毛细血管的通透性，维护肠道黏膜屏障的正常功能，从而降低血中内毒素水平，预防MODS的发生。其中大黄为必用药物，近来研究证明，大黄对胃肠黏膜有明显保护的作用[2]。它可提高脓毒症患者胃肠黏膜内pH值，改善胃肠道血流灌注，缓解胃肠黏膜缺血缺氧。动物实验也表明，其可促进胃肠黏膜内杯状细胞增生，清除氧自由基，抑制细菌移位。内毒素休克大鼠给予大黄治疗可明显降低内毒素所致胃肠道微血管通透性，抑制肠道内毒素吸收，机制可能与大黄抑制内毒素休克大鼠血浆和肠壁血小板活化因子及磷脂酶A2(PLA2)的生成有关。近年来，研究还发现，肠缺血再灌注损伤过程中，大黄能提高缺血再灌注损伤肠道热休克蛋白（HSP70）表达[3]。HSP70有免疫调节、炎症调节、抗氧化、抗细胞凋亡及改善组织代谢等作用。Singleton KD等[4]发现，使用热休克因子表达抑制剂槲皮素等来阻止HSPs的表达后，谷氨酰胺介导的保护肠道，促进肠功能恢复的作用则大大减弱。可见大黄对肠道的保护作用与多种机制相关。

TNF-α作为促炎介质中的首动因子及致炎损伤网络的中心环节，在肠缺血再灌注损伤中起着重要的作用，它可诱发IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子（PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，由此产生炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。IL-10是一种有效的抗炎介质，可拮抗TNF-α，产生保护作用，但产生过多可引起免疫抑制。李文雄等[5]对32例脓毒症患者进行研究，检测其血清TNF-α、IL-10浓度并计算IL-10/TNF-α比值，发现血清IL-10水平或IL-10/TNF-α比值高的脓毒症患者，预后差。我们的研究表明，清营泻瘀方联合力肽在肠I/R早期能够降低大鼠血清促炎介质TNF-α的表达水平，晚期能够降低抗炎介质IL-10的表达水平，阻断炎症级联反应，提高机体的免疫功能。

D-乳酸是肠道固有细菌的代谢终产物，由于其他哺乳动物机体各组织既不能产生D-乳酸也没有快速代谢分解D-乳酸的酶系统，所以外周血D-乳酸主要来源于肠道，而其在肝内不被分解，故其水平可反映肠道机械屏障的功能状态。大多研究[6-7]表明，急性肠缺血引起的肠黏膜损伤可使血D-乳酸浓度迅速升高，并且D-乳酸含量与内毒素浓度呈显著正相关。清营泻瘀方通过荡涤肠胃宿垢、致病菌和毒素，降低炎症介质的含量而消除肠道瘀滞状态，减少肠道有害物质的吸收，减少肠道细菌移位，保护肠屏障功能，减少肠道细菌和内毒素移位。

肠缺血再灌注损伤是多种因素参与的复杂病理过程，而目前单一的药物治疗往往无法奏效，所以只有全面考虑，尽可能地打断多种环节的影响，才有可能取得突破性的进展。中西医结合保护肠I/R损伤有着很大的发展空间，但其应用方式、剂量、副作用及长期疗效尚不肯定，缺乏严谨的临床实验设计及大样本的对比研究，值得做进一步研究。我们应针对肠道缺血再灌注损伤的发病机制，对中西药物结合的药理作用做更进一步的研究，在临床方面进行较大规模的前瞻、多中心研究，采用循证医学的方法对中西医结合保护肠缺血再灌注方面的最终疗效进行客观的评价，并进一步研制开发出更为有效的药物，从而为早期防治创伤后脓毒症和MODS的研究开辟新的途径。

[1]吴志明，陈江，储修峰，等．清营泻瘀方对肠缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制[J].中国中西医结合外科杂志，2010，(16)5：557-560.

[2]陈德昌，杨兴易，景炳文，等.大黄对危重病患者多器官功能衰竭综合征的防治研究[J].中华急诊医学杂志，2004，13(2):103-106.

[3]孙家艳，朱海蓉，谈定玉.大黄对肠缺血再灌注大鼠肠黏膜和通透性的影响及其机制[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13(4)：392－395.

[4]Singleton KD，Serkova NP，Beckey VE，et al.Glutamine attenu⁃ates lung injury and improves survival after sepsis:Role of en⁃hanced heat shock protein expression[J].Crit Care Med，2005，33(6):1206-1213.

[5]李文雄，陈惠德，王小文，等.脓毒症患者血清TNFα、IL-10水平、IL-10/TNFα比值的变化及其临床意义[J].中华普通外科杂志，2003，18(4):229-231.

[6]柳勒龙，田晓峰，张雪梅，等．D－乳酸在急性肠缺血早期诊断中的价值[J].中华实验外科杂志，2004，(21)4：497-450.

[7]吴彪，王春友.急性胰腺炎肠道屏障功能损伤时血浆内毒素和D2乳酸的变化[J].中华普通外科杂志，2009，18(3):224-227.