核转录相关因子与脏器损伤研究进展

刘国艳，余剑波，刘晓东

核转录相关因子与脏器损伤研究进展

刘国艳1，余剑波2，刘晓东1

氧化应激损伤与机体多种病理过程密切相关，Nrf2/ARE信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路。大量的临床研究证实，Nrf2对多种疾病的病理状态有多器官保护作用。本文重点阐述Nrf2/ARE信号通路对脏器损伤可能的保护机制。

核转录相关因子；脏器损伤；氧化应激

目前认为,多种疾病的发生、发展均与氧化应激相关。在代谢过程中不断产生的自由基,可攻击大分子物质，增加DNA突变，造成功能蛋白合成误差,破坏细胞膜结构，促进核酸和蛋白质的分子内和分子间逐步发生化学交联反应。使细胞不能发挥正常的功能,终至死亡,从而引发机体衰老、诱发肿瘤等恶性疾病。核转录相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是重要的转录因子,在氧化应激等情况下被激活，与Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)解离，进入胞质启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表达,增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[1]。抗氧化系统与脏器损伤的关系是近几年的研究热点,本文就Nrf2/ARE信号通路对脏器损伤可能的保护机制进行综述。

1 Nrf2的结构及其调控

1.1 Nrf2的基本结构 Nrf2是一种含有亮氨酸拉链基本结构的转录因子，属于 Cap-n-collar（CNC）调节蛋白家族。Nrf2含有多个同源结构域,分别命名为Neh1-6，Neh1有一个CNC型样的亮氨酸拉链结构,是Nrf2与DNA结合及与其他转录因子形成二聚体的必要条件。Neh2位于N端,包含数个可与泛素结合的赖氨酸残基,从而介导蛋白酶对Nrf2的降解，以实现Nrf2活性的负性调节。此外,Neh2还可以与Keap1的Kelch结构域结合。C端的Neh3对于维持Nrf2的转录活性必不可少。Neh4和Neh5是两个富含酸性残基的独立转录结构域,可以和CREB结合蛋白(CBP)相互作用。Neh6含有大量的丝氨酸残基,但精确功能未知[2]。

1.2 Nrf2的调控机制 Nrf2的活性由负性调节蛋白Keap1精确调控。Keap1可能分别与肌动蛋白细胞骨架和Nrf2相结合，从而将Nrf2限制于细胞质中。当细胞暴露于氧化应激或者化学预防剂时,Nrf2从Keap1中解离,易位至细胞核,与Maf结合成异二聚体,进一步激活了抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）介导的下游基因表达[3]。研究证实，Keap1的作用不仅仅是将Nrf2固定在细胞质,而且在靶向Nrf2泛素化和蛋白酶降解中也起积极作用。体内外研究均对Nrf2-Keap1的分离模型进行了验证[4]。虽然Keap1介导的泛素化及降解是控制Nrf2活性的主要途径,但仍存在其他的调控模式,主要包括亚细胞定位、转录后修饰及磷酸化,具体机制仍在研究中[5]。

2 Nrf2/ARE信号通路与脏器损伤可能的保护机制

2.1 Nrf2/ARE通路与肺脏 Nrf2与多种肺脏疾病的发生有密切关系。研究表明，Nrf2在小鼠实验性颅脑损伤所致的ALl中发挥调节作用,通过中度体重下降诱发小鼠脑损伤，与Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2-/-小鼠肺毛细血管通透性、湿/干重比和肺泡细胞凋亡加剧,肺损伤加重与炎症因子(TNF-α，IL-1ß，IL-6)表达增多和肺抗氧化和解毒酶(GST、NQO1)减少有关[3]。Rangasamy等[6]研究指出在同等浓度慢性香烟烟雾暴露的情况下,Nrf2基因缺失鼠肺气肿症状更明显。此外，有研究发现，COPD病人较健康人的肺组织氧化应激水平增加，Nrf2相关的抗氧化物和谷胱甘肽（GST）减少，Nrf2蛋白减少而Nrf2 mRNA保持不变，DJ-1蛋白水平下降。说明COPD病人存在氧化/抗氧化失衡,而Nrf2蛋白的稳定性下降和Nrf2依赖的抗氧化产物的表达减少,是COPD的重要发病机制[7]。叔丁基对苯二酚（tBHQ）是公认的酚型抗氧化蛋白的强诱导剂，它通过激活Nrf2蛋白，促进Nrf2的核转位，增加其与ARE的结合，调节抗氧化蛋白基因的表达[8]。Iizuka等[9]研究表明Nrf2基因缺失小鼠香烟烟雾诱导性肺气肿的发生较野生型小鼠明显提前；ARE介导的抗氧化/抗炎症基因表达不足,支气管肺泡灌洗液中性白细胞弹性蛋白酶活性、巨噬细胞、氧化应激产物明显增加。血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）是Nrf2/ARE通路调节的一个重要蛋白。已有研究表明，HO-1与内毒素急性肺损伤的严重程度和转归有着密切关系，内毒素休克大鼠肺脏HO-1表达上调对肺脏发挥着一定的保护作用。小鼠内毒素急性肺损伤时HO-1mRNA增高、蛋白表达增多，HO-1可通过抗氧化、抑制细胞因子释放减轻内毒素引起的肺损伤[10]。

2.2 Nrf2/ARE通路与肝脏 氧化应激与肝脏疾病的发生密切相关。氧化应激主要通过启动膜脂质过氧化改变生物膜功能、与生物大分子共价结合及破坏酶的活性等在细胞因子(如TNF-α,NF-κB)的共同作用下引起不同程度的肝损伤。Nrf2-Keap1抗氧化系统涉及肝脏的各个领域,如调节肝脏的代谢、解毒及促进肝细胞再生,在肝损伤、脂肪肝、肝纤维化及肝癌等方面也具有保护作用。

运载体是肝脏对药物和环境化学毒物解毒的完整组件，肝脏的Nrf2-Keap1抗氧化系统通过Ⅱ相解毒酶和运载体调节代谢和转运过程来参与药物、胆固醇、糖的代谢及解毒，如Nrf2缺失小鼠使扑热息痛的葡萄糖酸化降低,导致N-乙酰-对-苯醌亚胺(NAPQ1)和肝毒性的增加。激活的Nrf2通过醌氧化还原酶(NQO1)及经由运载体多药耐药相关蛋白3 (MRP3)增加对扑热息痛葡萄糖苷酸化代谢产物的排除，来促进NAPQ1的解毒。Nrf2缺失小鼠能抵制胆结石的形成, Nrf2在肝脏对胆固醇的摄取、代谢及排泄方面有一定的影响。在链唑霉素诱导的小鼠1型糖尿病中,Nrf2缺陷小鼠肝脏糖异生葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸丙酮酸羧基激酶的mRNA增加，并且糖酵解丙酮酸激酶的mRNA减少,所以导致小鼠高血糖和尿排出量增加[11]。楤木属根的乙醇抽提物对叔丁基-过氧化氢(t-BHP)所致的肝毒性的保护作用，是经由Nrf2信号途径的抗氧化酶HO-1起作用[12]。

Nrf2敲除小鼠对扑热息痛诱导的肝损伤、笨芘诱导的肿瘤和Fas-以及TNF-α介导的肝细胞凋亡很敏感,Nrf2敲除小鼠对化学毒物的高度敏感性是因为减少了解毒酶的表达[13]。对姜黄素的研究中发现口服姜黄素不仅仅能保护二甲基亚硝胺(NDMA)诱导的肝损伤,而且使鼠肝的HO-1蛋白的表达和活性高度增加,HO-1的抑制剂锌-原卟啉Ⅸ能废除姜黄素对DMN诱导肝损伤的保护作用。姜黄素保肝作用在于能诱导Nrf2与 ARE元件结合启动HO-1的表达[14]。Lamle等[15]报道,Nrf2(-/-)小鼠对酒精的耐受性比野生型小鼠明显降低,很快就发生了肝衰竭导致死亡。Nrf2缺陷小鼠对CCl4所致肝损伤的修复明显延迟,Nrf2敲除小鼠肝纤维化及炎症明显加重。这是由于肝细胞目标基因Nrf2及其编码酶的减少,对CCl4和其代谢产物的解毒作用减弱所致。Nrf2可能是预防或减轻毒素诱导的肝损伤和肝纤维化的一个新奇的目标。抗氧化剂tBHQ能促进细胞外基质中培养的静止肝星状细胞(hepatic stel-late cell,HSC)的转化,能诱导经由Nrf2的ARE的表达。Nrf2调整的抗氧化酶及解毒酶的基因多态性与肝癌的发生密切相关[16]。Nrf2可通过调节肝脏Ⅱ相酶基因的表达增加肝脏抵抗氧化应激的能力,Nrf2对于肝脏疾病的预防和治疗是一个重要的目标。

2.3 Nrf2/ARE通路与消化道系统 细胞氧化还原稳态的改变与消化道肿瘤的发生发展有密切联系。Hayes等[17]报道，Nrf2在鼠的小肠、胃、中表达量极高，推测Nrf2可能对介导小肠和胃中氧化应激反应起重要作用。高表达的Nrf2在消化道中调控一系列ARE靶基因的表达，而不同的器官Nrf2调控表达的基因数量和种类不同。Wang等[18]研究发现在正常胃黏膜、胃癌前病变及胃癌中,Nrf2的表达逐渐升高,且差异有统计学意义。Nrf2在核内堆积的主要原因是Nrf2或Keap1突变引起的。在Nrf2-null老鼠、Nrf2-null-MEF细胞，以及各种癌细胞模型中研究消化道癌症，包括胃、大肠、小肠中Nrf2诱导的二相解毒酶的表达发现，在消化道中，醌氧化还原酶（NQO1）、葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）诱导表达作用明显，是消化道 Nrf2/Keap1/ARE通路研究的主要检测指标。

2.4 Nrf2/ARE通路与肾脏 机体内氧化还原水平失衡是肾脏疾病重要的病理生理基础之一。HO-1是受Nrf2调节的最重要的抗氧化蛋白酶。有研究发现[19]，急性肾损伤模型动物中，HO-1 mRNA的水平上升；HO-1基因敲除的小鼠表现出更严重的肾衰竭及更高的死亡率。Nrf2对糖尿病肾病、急性肾损伤及肾脏纤维化的保护作用已被普遍证实;然而，在肥胖相关性肾病模型中，Nrf2对脂肪的聚集以及胰岛素抵抗和糖耐受的作用目前还存在争议，Nrf2能否对代谢综合征尤其是肥胖患者肾脏起到保护作用仍然有待验证。Nrf2可能在多种肾脏疾病中成为潜在的治疗靶点，今后有赖更多转化医学的研究，共同促进其从基础到临床的实践。

2.5 Nrf2/ARE通路与神经系统 氧化应激是许多神经退行性疾病起始和发展的重要因素。大量实验发现Nrf2/ARE信号通路有神经保护作用，Lee等[20]认为，Nrf2是通过拮抗线粒体复合物Ⅵ阻滞剂和提高细胞内钙浓度来发挥神经保护作用。Hwang等[21]发现，咖啡白脂预处理的神经细胞能够激活Nrf2及其下游的HO-1的表达,保护神经细胞免受帕金森相关神经毒素6-hydroxydopamine（6-OHDA)的损伤,且能够被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和p38蛋白（p38）的抑制剂所抑制。有研究证实，帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病与还原型GST减少以及Ⅱ相解毒酶失调引起的氧化或过氧化有关。在创伤性脑损伤时，Nrf2及其调节的NQO1等Ⅱ相解毒酶水平显著增加。说明Nrf2/ARE信号通路是创伤性脑损伤时的内源性适应机制[22]。Nrf2信号通路诱导剂莱菔硫烷、姜黄素等也在实验中表现出抗氧化应激、减少脑水肿和神经炎症等功能。随着研究的深入开展,Nrf2将为多种中枢神经系统疾病的治疗提供新的思路。

2.6 Nrf2/ARE通路与心血管系统 Nrf2在心血管稳态的调节中发挥重要作用。有证据表明，Nrf2能够协调多数抗氧化基因和细胞保护基因的表达，防御有害应激诱导的心血管系统细胞和组织的损伤。Nrf2缺失能导致心脏成纤维细胞和心肌细胞对活性氧和活性氮诱导的细胞毒性的易感性增高。在心肌重塑的早期阶段Nrf2表达上调，但随着心脏功能的进一步衰退，Nrf2表达下降，同时伴随着心脏功能障碍和病理性的压力负荷过大，过表达Nrf2抑制心肌细胞的氧化应激，敲低表达后有相反的作用。而且，在病理性血流动力学的应激状态下，由于Nrf2缺失阻断了其目的基因HO-1、NQO1、SOD2、SOD3、Trxl、TrxlR和GPx的上调，导致不正常的心肌重塑[23]。有研究证明，CO能够激活ERK信号通路，调节Nrf2依赖的HO-1的表达，抵抗内质网应激引起的内皮细胞损伤，氧化性的磷脂类物质很可能通过激活Nrf2提供另外一种途径，将他们对内皮细胞的有害作用降低，同时Nrf2的活化也能够逆转高血糖引起的内皮细胞的功能障碍[24]。这些结果表明,Nrf2／ARE信号通路在调节内皮细胞功能方面发挥重要作用。在氧化应激过程中，Nrf2／HO-1通路的活化有助于血管平滑肌细胞的存活，但Nrf2的活化同时能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。越来越多的证据显示，在衰老的血管平滑肌细胞中，Nrf2有助于GST的稳定[25]。然而，到目前为止Nrf2调节血管平滑肌细胞生物学功能的具体机制尚不清楚。随着研究的深入，将有助于人们进一步认识Nrf2在心血管系统中的作用和生物学意义。

3 结语

大量研究证实，Nrf2能够抵御广谱的毒性物质和致病原对细胞的损伤。Nrf2介导的细胞保护无细胞特异性和器官特异性，Nrf2的这种谱特性使Nrf2对于脏器损伤具有巨大的治疗潜力。相信随着Nrf2研究的进一步加深,多器官保护剂Nrf2的应用模式也将不断进步,从而使脏器损伤的预防成为可能。

[1]Kung CW,Lee YM,Cheng PY,et al.Ethyl pyruvate reduces acute lung injury via regulation of iNOS and HO-1 expression in endotoxemic rats[J].J Surg Res,2011,167(2)：323-331.

[2]Li Y,Panonessa J D,Zhang Y S.Mechanism of chemical activation of Nrf2[J].PLoS One,2012,7(4)：35122-35128.

[3]Chen HL,Xu WL,Liu DP,et al.The Anti-inflammatory mechanism of heme oxygenase-1 induced by hemin in primary rat alveolar macrophages[J].Inflammation,2012,35(3)：1087-1093.

[4]Yu JB,Dong SA ,Luo XQ,et al.Role of HO-1 in protective effect of electro-acupuncture against endotoxin shock-induced acute lung injury in rabbits[J].Exp Biol Med(Maywood),2013,238(6)：705-712.

[5]Niture S K,Kaspar J W,Shen J,et al.Nrf2 signaling and cell survival[J].Toxicol Appl Pharmacol,2010,244(1)：37-42.

[6]Rangasamy T,Cho CY,Thimmulappa RK,et al.Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induce emphysema in mice[J].J.Clin.Invest,2004,114(9)：1248-1259.

[7]Aoshiba K,Zhou F,Tsuji T,et al.DNA damage as molecular link in the pathogenesis of COPD in smokers[J].Eur Respir J，2012,39 (6)：1368-1376.

[8]Shen G,Jeong WS,Hu R,et al.Regulation of Nrf2,NF-kappaB,and AP-1 signaling pathways by chemopreventive agents[J].Antioxid Redox Signal,2005,7(11-12)：1648-1663.

[9]Iizuka T,Ishii Y,Itoh K,et al.Nrf2-deficient mice are highly susceptible to cigarette smoke induced emphysema[J].Genes Cells，2005，10(12)：1113-1125.

[10]吴丽丽,余剑波,宫丽荣,等.活化蛋白-1在大鼠内毒素性肺损伤时血红素加氧酶-1上调中的作用[J].中华麻醉学杂志,2012,32（9）：1146-1149.

[11]Aleksunes L M,Reisman S A,Yeager R L,et al.Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 deletion impairs glucose tolerance and exacerbates hyperglycemia in type 1 diabetic mice[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,333(1)：140-151.

[12]Beyer TA,Xu W,Teupser D,et al.Impaired liver regeneration in Nrf2 knockout mice：role of ROS-mediated insulin/IGF-1 resistance[J].EMBO J 2008，27(1)：212-223.

[13]Baird L,Dinkova-Kostova AT.The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J].Arch Toxicol,2011,85(4)：241-272.

[14]李晶菁,张霞,陈瑜,等.Nrf2在脓毒症大鼠肝组织中的表达及姜黄素的干预作用[J].重庆医学,2013,42(24)：2873-2876.

[15]Lamle J,Marhenke S,Borlak J,et al.Nuclear factor-eythroid 2-related factor2 prevents alcohol-induced fulminant liver injury[J]. Gastroenterology，2008,134(4)：1159-1168.

[16]Collins AR,Gupte AA,Ji R,et al.Myeloid deletion of nuclear factor erythroid 2-related factor2 increases atherosclerosis and liver injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(12)：2839-2846.

[17]Hayes JD，McMahon M． NRF2 and KEAP1 mutations：permanentactivation ofan adaptive response in cancer[J].Trend Biochem Sci,2009,34(4)：176-188．

[18]Wang HB,Zhou CJ,Song SZ,et al.Evaluation of Nrf2 and IGF-1 expression in benign,premalignant and malignant gastric lesions[J]. Pathol Res Pract 2011，207(3)：169-173.

[19]Park J-G,Yoo J-Y,Jeong S-J,et al.Peroxi redoxin 2 deficiency exacerbates atherosclerosis in apolipo protein E-deficient mice[J]. Circ Res,2011,109(7)：739-749.

[20]Lee IM,Shih AY,Murphy TH,et al.NF-E2 related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons[J].J Biol Chem,2003,278(39)：37948-37956.

[21]Hwang YP,Jeong HG.The coffee diterpene kahweol induces hemeoxygenase 1 via the PI3K and p38/Nrf2 pathway to protect human dopaminergic neurons from 6 hydroxydopamine derived oxidative stress[J].FEBS Lett,2008,582(17)：2655-2662.

[22]Zhang MJ,An C,Gao Y.Emerging roles of Nrf2 and phaseⅡantioxidantenzymes in neuroprotection [J].Prog Neurobiol,2013, 100(1)：30-47.

[23]Sugamura K,Keaney JF.Reactive oxygen species in cardiovascular disease[J].Free Radic Biol Med,2011,51(5)：978-992.

[24]Barajas B,Che N,Yin F,et al.NF-E2-related-factor 2 promotes atherosclerosis by effects on plasma lipoproteins and cholesterol transport that overshadow antioxidant protection[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(1)：58-66.

[25]Redington KL,Disenhouse T,Li J,et al.Electroacupuncture reduces myocardial size and improves post-ischemic recovery by invoking release of humoral,dialyzable,cardioprotectivefactors[J].J Physiol Sci,2013,63(3)：219-223.

（收稿：2014-06-15 修回：2014-11-12）

（责任编辑 傅 强 屈振亮）

R971+.1

A

1007-6948(2014)06-0667-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.06.038

国家自然基金（81372096）

1.天津市北辰医院麻醉科（天津 300400）

2.天津市南开医院麻醉科（天津 300100）

余剑波，E-mail：jianboyu99@sina.com.cn