发酵剂及玉米浆对苹果渣发酵饲料氨基酸含量及种类的影响

■陈姣姣 来航线 马军妮 薛泉宏

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌712100)

随着我国畜牧业和饲料工业的发展，饲料原料匮乏及成本不断增加已成为制约养殖业发展的重要因素。我国是苹果生产大国，每年因苹果汁加工产生苹果渣300多万吨。利用苹果渣作饲料可以有效解决饲料原料不足，但苹果渣中蛋白质、脂肪含量低，苹果酸、单宁、果胶及其他碳水化合物含量高，直接饲喂易引起胃内酸度过大，造成肠道微生态平衡失调，影响摄食量和消化利用率[1]。通过发酵提高发酵产物蛋白质含量可以改善发酵饲料的营养品质。近年国内研究者对苹果渣发酵工艺进行了较多研究，但重点集中在发酵对饲料蛋白质含量的影响[2-3]，对发酵引起的氨基酸含量及种类变化关注不多，影响了对苹果渣发酵饲料的营养评价。本文重点研究发酵剂及玉米浆对苹果渣发酵产物氨基酸种类及含量的影响，旨在为苹果渣发酵饲料营养品质评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种及复合发酵剂

黑曲霉 UA8（Aspergillas niger）、白地霉 B1410（Geotrichum candidum）及酵母菌（Yeast）均由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室提供。

发酵剂：2种复合发酵剂分别为白地霉+黑曲霉（Geotrichum candidum+Aspergillus niger，缩写为GcAn）及酵母菌+黑曲霉(Yeast+Aspergillus niger，缩写为YAn)组合。

1.1.2 培养基

菌种活化培养基：黑曲霉UA8活化及孢子悬液制备为PDA固体培养基及麸皮培养基；白地霉B1410、酵母菌活化及液体菌种制备用PDA固体培养基及PDA液体培养基，参考程丽娟等方法[4]。

苹果渣固态发酵原料：烘干苹果渣由眉县恒兴果汁有限公司提供。玉米浆由商惠酒精有限公司提供。尿素从市场购买。原料A按苹果渣∶尿素=19∶1的质量比配制；原料B按苹果渣∶玉米浆干粉∶尿素=17∶2∶1的质量比配制。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

黑曲霉UA8孢子悬液制备采用贺克勇法[5]，白地霉B1410及酵母菌悬液制备采用任雅萍法[6]。血球计数法测得UA8孢子悬液、B1410及酵母菌悬液浓度分别4.32×108、4.09×108和4.50×108cfu/ml。将上述UA8孢子悬液与B1410细胞悬液及UA8孢子悬液与酵母菌悬液分别按1∶1体积比混合，组成两种复合发酵剂菌悬液。

1.2.2 方案

试验共设4个处理：原料A+GcAn，原料B+GcAn，原料A+YAn，原料B+YAn，每处理重复3次。以未发酵苹果渣原料为对照组（CK）。

1.2.3 固态发酵

称取A、B发酵原料各50.0 g装入650 ml组培瓶中，按干原料∶水=1∶2加100 ml自来水，不灭菌；按1.2.2方案分别接入复合发酵剂GcAn或YAn复合悬液6 ml，充分混匀，28℃培养72 h，40℃烘干，粉碎过筛备用。

1.2.4 氨基酸含量测定

发酵产物中氨基酸总量测定：称取1.2.3过程制备的发酵产物1.000 g放入水解管中，加6 mol/l盐酸10 ml，3～4滴新蒸馏苯酚，110 ℃水解22 h，冷却、过滤、定容。吸取滤液1 ml于5 ml容量瓶，40℃真空干燥，残留物用1 ml去离子水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1 ml pH值2.2的缓冲液溶解备用。

水溶性氨基酸测定：称取1.2.3过程制备样品1.500 g于小三角瓶中，加5%三氯乙酸50 ml，加盖小漏斗在水浴锅上沸浴，维持15 min，充分摇匀过滤，收集滤液备用。

以上样品中氨基酸含量均用L-8900氨基酸分析仪测定。

1.2.5 结果计算

氨基酸发酵增率（⊿f）、玉米浆氨基酸增率（⊿B）采用下式计算：

式中

：Cck——未发酵苹果渣氨基酸总量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

Cf——原料发酵产物氨基酸总量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)；

CA——原料A发酵产物氨基酸总量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

CB——原料B发酵产物氨基酸总量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)。

2 结果与分析

2.1 发酵产物氨基酸总量及影响因素

2.1.1 发酵剂(见表1)

由表1可知，接种复合发酵剂GcAn、YAn后其发酵产物的氨基酸含量大幅度增加。原料A发酵产物的氨基酸总量为49.48、66.54 g/kg；基本氨基酸含量为26.43、40.64 g/kg；必需氨基酸含量的增加幅度分别为34.9%～191.3%、46.3%～197.1%；基本氨基酸（除GcAn谷氨酸外）增幅分别为30.8%～95.4%、48.4%～125.2%。蛋氨酸分别增加191.3%、197.1%，精氨酸分别增加73.6%、102.9%。

表1 苹果渣发酵产物氨基酸总量

在原料B中，接种发酵剂GcAn、YAn发酵产物的氨基酸总量增加86.2%、83.2%，必需氨基酸增加78.2%、70.7%及基本氨基酸增加91.7%、92.0%，除谷氨酸、胱氨酸、丙氨酸及蛋氨酸外，其他氨基酸增率大致相同。由表中数据可知，在原料A中发酵剂YAn效果优于GcAn，而在原料B中两种发酵剂无明显差异。

2.1.2 玉米浆(见表2)

从表2中的⊿B数值看出，在GcAn接菌处理中，加入玉米浆对发酵产物中氨基酸总量影响较大。加玉米浆后，发酵产物的必需氨基酸增加11.8%～32.4%；除丙氨酸外，基本氨基酸增加11.0%～1 068.2%，其中谷氨酸含量较未加玉米浆对照组增加1 068.2%。在接种YAn处理中，加入玉米浆对发酵产物中氨基酸总量影响不大，有5种必需氨基酸及3种基本氨基酸含量减少，其中蛋氨酸含量下降91.4%，其余氨基酸下降0.3%～4.5%。试验结果说明玉米浆对GcAn影响较大，而YAn不受其影响。

表2 玉米浆对发酵产物氨基酸总量的影响(⊿B，%)

2.2 水溶性氨基酸含量及影响因素

2.2.1 发酵剂(见表3)

从表3可知，苹果渣经固态发酵后水溶性氨基酸种类变化很大。8种在苹果渣原料中未检出的氨基酸，有7种在发酵产物中检出。在发酵后新增加的7种氨基酸中，3种必需氨基酸分别为异亮氨酸、苏氨酸及蛋氨酸；4种基本氨基酸分别为丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸及丝氨酸。另外，与发酵原料苹果渣相比，发酵后水溶性组氨酸消失。

表3 苹果渣发酵产物水溶性氨基酸含量

在接种GcAn发酵剂时，原料A、B发酵产物的水溶性氨基酸总量较原料(对照组)分别增加181.5%、305.0%，水溶性必需氨基酸较原料对照分别增加518.6%、637.4%，水溶性基本氨基酸较原料对照组分别增加143.3%、267.3%，其中，基本氨基酸中的谷氨酸及必需氨基酸中的亮氨酸增幅最大，分别为1 535.1%、1 688.1%及1 447.8%、1 096.6%。接种YAn发酵剂时，原料A、B发酵产物中的水溶性氨基酸总量较原料(对照组)分别增加215.1%、272.0%，水溶性必需氨基酸量较原料对照组分别增加466.6%、675.4%，其中有7种(酪氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸)、10种氨基酸（丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸）含量低于GcAn接种处理。由此可知，除天门冬氨酸、脯氨酸和组氨酸外，2种发酵剂均可增加苹果渣中所余14种水溶性氨基酸的含量，其中，水溶性谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸的含量增加尤为明显。单从水溶性氨基酸含量的角度考虑，以原料A、B为发酵基质进行发酵时，接种GcAn复合发酵剂时效果较好。

2.2.2 玉米浆(见表4)

表4 玉米浆对发酵产物水溶性氨基酸含量的影响(⊿B，%)

由表4可知，加入玉米浆后可使发酵产物中的水溶性氨基酸含量出现不同变化，而种类无变化。如接种YAn发酵剂时，水溶性必需氨基酸及水溶性基本氨基酸总含量均增加，除去5种末检出氨基酸，其余12种氨基酸，8种水溶性氨基酸含量增加，其中4种必需氨基酸增加29.8%～75.0%；4种水溶性氨基酸含量减少，其中3种必需氨基酸减少6.3%～14.2%。在接种发酵剂GcAn时，也有类似趋势。说明玉米浆的加入使水溶性氨基酸总量略有增加，对各种水溶性氨基酸的含量影响不一，对水溶性氨基酸的种类无影响。

3 结论与讨论

本研究表明，采用2种复合发酵剂均能显著提高苹果渣发酵产物的氨基酸总量及水溶性氨基酸含量，增加某些水溶性氨基酸种类，改善苹果渣发酵饲料的营养品质。其中蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸及缬氨酸等动物必需氨基酸或水溶性必需氨基酸含量增加对营养品质的改善意义更大。两种发酵剂的发酵产物在氨基酸总量上无明显差异。

本研究采用酵母、白地霉与黑曲霉组成的复合发酵剂对苹果渣进行混菌发酵。发酵剂中的黑曲霉主要用于产生纤维素酶、果胶酶、糖化酶及等水解酶，将苹果渣中的大分子碳水化合物水解为小分子糖类供酵母菌生长，以合成单细胞蛋白；酵母菌及白地霉主要用于利用水解产生的小分子糖类及加入的尿素氮合成单细胞蛋白质。即复合发酵剂利用黑曲霉与酵母菌或白地霉共同作用将底物中的非蛋白氮转化为菌体蛋白。此外，黑曲霉还能合成蛋白酶，将苹果渣中的植物性蛋白质及发酵产物中的部分单细胞蛋白水解为氨基酸，增加水溶性氨基酸种类及含量。因此，发酵产物中的氨基酸总量与微生物菌体的生长及单细胞蛋白质数量有关，其中的水溶性氨基酸含量与发酵产物中植物性蛋白质及微生物蛋白质水解有关。在不同的发酵剂组合中，水溶性氨基酸种类及含量差异很大，其含量取决于植物及菌体蛋白质的酶解量与水解释放的氨基酸被微生物利用的程度。

试验方案中向发酵原料中加入玉米浆的目的是改善发酵原料中微生物的营养条件，促进微生物的生长繁殖，特别是提高产酶真菌生长及胞外酶的合成与分泌，促进对苹果渣中大分子碳水化合物水解及单细胞蛋白质的合成，提高发酵产物中单细胞蛋白数量、动物必需氨基酸数量及水溶性氨基酸含量。玉米浆发酵产物的氨基酸总量及水溶性氨基酸总量在接种两种发酵剂时均增加，其中接种白地霉+黑曲霉发酵剂时9种必需氨基酸总量的增幅达到11.8%～32.4%，即加入玉米浆对发酵产物的品质提高作用显著，但也应注意到，少数氨基酸含量减少。

苹果渣发酵饲料的氨基酸含量虽有报道[7-8]，但对发酵产物中的水溶性氨基酸变化缺乏研究，不同发酵剂及原料组成对发酵产物中氨基酸含量的影响亦不清楚。本研究将为苹果渣发酵饲料的营养评价提供较为系统的氨基酸资料。