发酵性接合酵母富铁能力分析及发酵条件的优化

■赖 颖 李青芝 冯盼盼 高 翔

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

铁是人体及动物必需的微量元素，是血红蛋白与肌红蛋白、细胞色素A以及某些呼吸酶的组成成分，参与体内氧与二氧化碳的转运、交换和组织呼吸过程，并具有增强免疫的功能[1-3]。据世界卫生组织统计，约有30%的世界人口存在铁缺乏现象，而90%的贫血现象是由于铁缺乏所引起的[4]。食物中铁的缺乏会引起贫血、免疫功能低下并诱发多种疾病，例如贫血性心脏病、舌炎、口角炎及各种感染性疾病和癌症等[5]。无机态的铁毒性较大，被机体吸收的水平很低。现存的普通口服铁剂，由于铁离子对胃肠道副作用大，因而限制了其使用[6]。研究低毒高效补铁剂是目前铁制剂开发的方向。

酵母菌具有富集多种微量元素的能力，其发酵工艺成熟，生产周期短，还可提供大量的菌体蛋白、氨基酸、丰富的B族维生素以及其他生物活性物质，是目前作为微量元素载体理想的菌种[7-8]。富铁酵母具有稳定性好、吸收率高、安全性好，与食物中其他成分协同配合性好，具有良好的风味等优点，所以富铁酵母作为强化食品的铁源是预防铁缺乏和缺铁性贫血的一项行之有效的措施。

本研究利用酵母属（Saccharomyces）中的发酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞能够将无机态的铁转化为有机形态的性质，采用在酵母培养过程中添加Fe2+的方法制备富铁酵母，并对影响酵母富铁的因素进行了研究，从而确定酵母富铁培养的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

发酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）：7株，周口师范学院发酵工程实验室提供，编号F-4、F-5、F-13、F-15、F-19、F-20、F-21。

1.1.2 培养基

YPD培养基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、葡萄糖40，pH值自然；YPS培养基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、蔗糖40，pH值7.2；YPM培养基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、麦芽糖40，pH值7.2；Wort培养基（g/l）：糖浓度为40 Birxe，pH值6.0；Mallases培养基（g/l）：蔗糖糖蜜 41、(NH4)2SO40.5、H3PO41.0，pH值自然；琼脂斜面培养基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10、琼脂条20，pH值自然；平板筛选培养基（g/l）：琼脂斜面培养基，150～200 mg/l铁离子浓度，pH值自然；发酵培养基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10，pH值自然。

1.1.3 仪器及试剂

仪器：AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；UV-5100型紫外/可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；JJ-CJ-2FD型超净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；DHP-9162型电子恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；PSM11R-090型pH计；SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；ZH⁃WY-2102C型双层恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；HC-3018型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有新公司）。

试剂：葡萄糖、硫酸亚铁、邻二氮菲、盐酸羟胺，试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 生物量的测定

取一定体积的发酵液4 000 r/min离心20 min，收集菌体，用蒸馏水洗涤酵母泥，离心，反复3次，收集菌体，置于干燥箱中60～80℃烘干至恒重，测定干细胞的重量，换算成1 L发酵液中含有的干细胞克数（g/l），即为细胞生物量。

1.2.2 铁含量的测定

精确称取0.2～0.3 g酵母干粉置于烧瓶中，加入浓硝酸∶高氯酸（4∶1）混合消化液5 ml置于电炉上，接上冷凝装置，回流冷凝消化至样液呈无色透明。冷却后，用蒸溜水冲洗并转移至100 ml容量瓶中，加水定容至刻度。然后准确吸取样品溶液2 ml于50 ml试管中，之后操作按标准曲线绘制的方法进行，在相同的工作条件下，测定样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出铁的含量。

铁含量：每克干酵母吸附的铁量（mg/g）；

生物量：每升培养液中含有的酵母干重（g/l）；

总铁含量（mg/l）=细胞生物量（g/l）×细胞铁含量（mg/g）。

1.2.3 菌种的选育

菌种的初筛：无菌条件下将23株初筛菌种接种至琼脂斜面培养基，28℃培养48 h复苏菌种，分别接一环菌种至100 ml种子培养基，28℃、200 r/min培养24 h得种子液。然后进行发酵培养，种子液接种量10%、Fe2+浓度150 mg/l、28 ℃培养48 h，取一定量的发酵液离心，烘干，收集菌体分别测定其生物量和铁含量。

菌种的复筛：从23株初筛菌株中筛选出7株总铁含量较高的菌种，制成菌悬液后适当稀释，然后涂布于含铁离子浓度200 mg/l的平板筛选培养基，30℃培养3 d后从平板中选取大而圆的菌落进行复筛，测定菌体的生物量和铁含量，从中筛选出1株总铁含量最高的菌株。

1.2.4 培养条件的优化

首先对影响菌株生长的碳源、氮源、Fe2+添加量、培养基装液量、种子培养基接种量、培养时间、起始pH值、摇床转速、铁添加时间、温度等因素进行考察，测定菌株F-13在不同影响因素下的生物量及铁含量；然后通过正交试验对菌株生物量及铁含量影响较大的因素水平进行进一步优化，确定富铁酵母F-13的最佳培养条件。

2 结果与讨论

2.1 菌种初筛和复筛

通过对23株不同种属的酵母菌进行初筛，发现不同酵母菌株对硫酸亚铁的抗性差异较大，不同菌株的生物量及铁含量均不相同。从初筛菌株中筛选出7株总铁含量较高的菌株进行复筛，结果见表1。菌株F-13铁含量及总铁含量均最高，故选择菌株F-13作为本试验的出发菌株。

表1 不同菌株细胞生物量及铁含量的分析

2.2 富铁酵母F-13发酵条件的优化

2.2.1 碳源对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在含有Fe2+80 mg/l、糖浓度40 g/l、恒温26 ℃、200 r/min的YPD、YPS、YPM、Wort和Mallases培养基中振荡培养48 h。分别测定其生物量、细胞铁含量，并计算细胞总铁含量，结果如图1所示，在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中，菌株F-13细胞生物量稍低，但细胞铁含量及总铁含量最高，故选择葡萄糖作为发酵培养基的碳源。

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图1 碳源对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

进一步研究了不同葡萄糖浓度对细胞生物量及铁含量的影响，结果如图2所示。在培养基葡萄糖浓度低于40 g/l时，随着糖浓度的增大，菌株F-13的生物量呈缓慢上升趋势，当糖浓度大于60 g/l时，对其生长产生一定的抑制作用，生物量趋于稳定。细胞铁含量则随着培养基葡萄糖浓度的增加呈下降趋势，并在葡萄糖浓度达到60 g/l时趋于稳定。综合考虑细胞生物量及铁含量，在葡萄糖浓度为40 g/l时细胞总铁含量达到最高，因此，选取葡萄糖的浓度为40 g/l。

2.2.2 氮源对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在发酵培养基中添加不同的氮源（硝酸铵、牛肉膏、尿素、蛋白胨、酵母膏），根据微生物的生长需求，培养基的配制一般采用碳氮比为4∶1，结果见图3。以蛋白胨为唯一氮源时，菌株F-13的细胞铁含量和总铁含量均高于其它氮源的细胞铁含量和总铁含量，故选择蛋白胨为发酵培养基的氮源。

图2 葡萄糖浓度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

图3 氮源对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

进一步研究不同蛋白胨浓度对细胞生物量及铁含量的影响，结果(见图4)表明，较高的蛋白胨浓度对细胞生物量及铁含量均有一定的抑制作用，随着蛋白胨浓度的继续增加，细胞生物量及铁含量均呈下降趋势，在蛋白胨浓度为10 g/l时细胞铁含量及生物量最高，故选择蛋白胨浓度为10 g/l。

图4 蛋白胨浓度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.3 初始pH值对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在上述优化培养基的基础上，研究不同初始pH值下菌株生物量及铁含量的富集情况。据图5可知，pH值过低抑制菌株的生长且不利于菌株对铁的吸收，随着培养基初始pH值的升高，酵母菌生长速度加快，细胞铁含量增加，当初始pH值大于6.0时酵母菌生长受到抑制，明显表现为酵母菌颜色发生变化。Brady等的研究表明，微生物吸收金属离子的最适pH值范围是在4.0～8.0之间，因此确定本试验的初始pH值为6.0。

图5 初始pH值对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.4 铁添加时间对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在上述培养条件优化的基础上，为确定最佳铁加入时间从而使酵母细胞获得较高的总铁含量。在不同发酵时间添加80 mg/l Fe2+，结果如图6。在发酵0～10 h，细胞总铁含量最高且基本趋于稳定。因此，在开始发酵的同时即加入硫酸亚铁。

图6 铁添加时间对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.5 装液量对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

利用不同的装液量来模拟不同的溶氧程度对菌株F-13生长的影响。分别用250 ml的三角瓶装入不同体积的培养基，测定菌株的铁含量和生物量，试验结果如图7所示。在250 ml三角瓶中，较大的装液量（低溶氧）有利于菌株F-13对铁的富集，而较小的装液量（高溶氧）对菌株F-13生物量的提高比较明显。综合考虑细胞生物量和铁含量，确定培养基装液量为50 ml/250 ml。

2.2.6 铁离子浓度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

为确定不同浓度的Fe2+对酵母生物量及铁含量的影响，分别配制Fe2+浓度为20、40、60、80、100、120、140、160、180 mg/l的培养基培养48 h，然后测定生物量及铁含量，结果见图8。硫酸亚铁的加入对酵母菌株的生长有抑制作用，但却促进酵母体内铁富集量的增加。当Fe2+的浓度为80～120 mg/l时，酵母生物量及铁含量达到最大值，当Fe2+浓度超过100 mg/l时，菌体总铁含量降低，分析原因可能是此时培养基中铁的浓度过高，抑制了酵母的生长和代谢。为确定多因素综合作用下的最佳条件，试验选择Fe2+浓度为80、100、120 mg/l作为正交试验的3个水平。

图7 装液量对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

图8 铁离子浓度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.7 培养时间对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在上述培养条件优化的基础上，为确定最佳菌体培养时间从而使酵母细胞获得较高的总铁含量。相同条件下培养菌体不同时间并分别测定其生物量及铁含量，结果如图9所示。在培养时间为12～48 h时，菌体铁含量刚开始变化不大，之后缓慢增加；菌体生物量，总铁含量均继续缓慢增加；在培养时间为48～60 h时，菌体铁含量变化不大，而菌体的生物量有所增加，铁含量仍缓慢上升，总铁含量达到最大值；当培养时间超过60 h后，铁含量变化不大，生物量及总铁含量明显降低。为确定多因素综合作用下培养温度的最佳水平，试验选择培养时间48、54、60 h作为正交试验的3个水平。

2.2.8 接种量对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

配制Fe2+添加浓度为100 mg/l的培养基，分别接种不同浓度的液体种子（v/v），使种子浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，26℃培养48 h，测其生物量及铁含量，结果如图10所示。随着接种量的增加，铁含量有下降趋势但变化不大，而酵母的生物量随接种量增加而增加，当接种量达到10%以后，生物量随接种量的增加变化不明显。在接种量为8%～10%范围内，细胞总铁含量达到最大，随着接种量的进一步增加，细胞总铁含量不再变化。

图9 培养时间对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.9 温度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

微生物的生命活动由一系列的生物化学反应所组成，而这些化学反应受温度的影响又极其明显，因此微生物的生长均有其特定的最佳温度范围，在最佳温度范围内培养微生物能够促进其生长和代谢活动[19]。结果如图11所示，在培养温度为28℃时，菌体的总铁含量最高，故选择培养温度为28℃。

图11 培养温度对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.2.10 摇床转速对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

在不同摇瓶转速0、100、150、200、300 r/min条件下观察菌体生长及发酵情况，结果如图12所示。富铁酵母在提高转速时菌体生长良好，且随着转速的提高，菌体生物量有所增加，静置时菌体生物量明显低于高转速时的生物量。综合考虑，虽然提高转速可以增加氧溶解速度，提高酵母菌的产量，但是菌体的含铁量变化并不明显，因此试验中选用的转速为200 r/min。

图12 摇床转速对菌株F-13细胞生物量及铁含量的影响

2.3 富集条件的正交优化

在上述单因素试验的基础上，为进一步确定多因素综合作用下酵母培养的最佳条件，采用正交试验L9（34），对细胞生物量和铁含量影响较大的葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、铁盐浓度及培养时间4个因子的水平进行了优化，每个因子取三种水平进行，正交试验设计见表2，结果表3。当仅考虑细胞生物量时，葡萄糖浓度是影响菌株F-13细胞生物量最重要的因子，其次为蛋白胨浓度，再次为培养时间及铁盐浓度；当仅考虑细胞铁含量时，铁盐浓度是影响菌株F-13细胞铁含量的最重要因子，其次为培养时间和蛋白胨浓度，再次为葡萄糖浓度；而综合考虑发酵液中的细胞总铁含量时，铁盐浓度是影响菌株F-13细胞总铁含量的最重要因子，其次为葡萄糖浓度，再次为蛋白胨浓度和培养时间。

表2 正交试验L9（34）因素水平设计

综合各因素对总铁含量的影响，确定菌株最佳培养条件为A2B2C3D1，即葡萄糖浓度40 g/l，蛋白胨浓度10 g/l，铁离子添加浓度120 mg/l，培养时间48 h。在该条件下进行验证试验，所得生物量为3.92 g/l，铁含量为7.04 mg/g。

表3 正交试验L9（34）结果

3 结论

通过对7株发酵性接合酵母菌株进行初筛及复筛，得到1株富铁能力强的菌株F-13作为出发菌株，确定其最佳发酵条件为：培养温度28℃，pH值为6.0，培养基Fe2+添加浓度为120 mg/l，摇床转速200 r/min，接种量10%，装液量50 ml/250 ml三角瓶，培养时间48 h。在此优化条件下获得的富铁酵母生物量可达到3.92 g/l，铁含量可达7.04 mg/g。经过筛选及优化后，菌株F-13的生物量及富铁量均有所提高，本试验所筛选出的菌种以及最佳培养条件为规模化生产铁酵母提供了参考，但酵母的富铁能力还不够理想，单位体积发酵液中菌体富集的总铁含量依然较低，为了培育出可用于工业化生产的优良菌种，有必要对其进行连续的改良，以便提高菌株的指标性能。