淫羊藿素抑制人脐静脉内皮细胞血管生成及其机制

吕 祥冯彦军夏 英刘 静侯风刚李 雁任建琳陈伟杰

（1上海市中医医院肿瘤科，上海，200071；2苏州市第五人民医院肿瘤科，苏州，215007；3上海市中医医院药物临床试验机构办公室，上海，200071；4上海市中医医院泌尿外科，上海，200071）

实验研究

淫羊藿素抑制人脐静脉内皮细胞血管生成及其机制

吕 祥1，3冯彦军2夏 英3刘 静1侯风刚1李 雁1任建琳1陈伟杰4

（1上海市中医医院肿瘤科，上海，200071；2苏州市第五人民医院肿瘤科，苏州，215007；3上海市中医医院药物临床试验机构办公室，上海，200071；4上海市中医医院泌尿外科，上海，200071）

目的：探讨淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）血管生成的抑制作用及其机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，分别观察淫羊藿素对其增殖、迁移及其小管形成的影响。采用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）的含量。结果：经淫羊藿素作用48 h后，未见对内皮细胞增殖有影响。淫羊藿素高浓度组（ICT1 10-6mol/L）、中浓度组（ICT2 10-7mol/L）、低浓度组（ICT3 10-8mol/L）和沙利度胺（TLD）组HUVEC细胞迁移数目（4.67±1.26）、（10.48±3.15）、（21.06±6.83）和（19.15±6.03）个，明显低于空白对照（Control）组（41.38±7.78）个（P＜0.01）。ICT1、ICT2、ICT3及TLD组小管形成的面积分别为（5 867.45±925.36）、（1 627.33±288.56）、（735.73±325.65）和（2 933.24±741.43）μm2/视野，均低于Control组（7 883.69±1 034.85）μm2/视野（P＜0.01）。经淫羊藿素处理后，HUVEC细胞分泌VEGF功能明显下降，而分泌PEDF功能明显升高。结论：体外实验结果表明淫羊藿素具有抑制HUVEC细胞血管生成的作用，这种效应与血管内皮细胞VEGF的活性降低及其合成受到抑制，同时对PEDF活性升高及其合成受到促进作用有关。

淫羊藿素；人脐静脉内皮细胞；血管新生；血管生成抑制剂

血管新生在人体正常发育以及许多疾病的发生与发展中起着重要作用，尤其与肿瘤的形成及转移关系密切[1]，新生血管保证了肿瘤持续生长所需要营养物质的有效供给，抑制肿瘤的血管新生，切断肿瘤生长和转移所依赖的命脉已经成为当前治疗肿瘤的重要策略之一[2]。现代药理研究表明，淫羊藿及其有效成分具有多种药理作用，以往研究发现淫羊藿苷可以诱导体外肿瘤细胞凋亡等作用[3-10]。淫羊藿素是淫羊藿活性成分之一，是淫羊藿苷在体内的一种代谢产物，在一定的浓度范围内具有雌激素样作用[11-12]。前期在鸡胚尿囊膜体内实验（Chick Chorioallantoic Membrane，CAM）研究中发现淫羊藿素对新生毛细血管生成具有明显抑制作用[13]。淫羊藿素是一种十分具有应用前景的抗肿瘤天然药物，但其作用机制尚不明确。本研究通过体外模拟血管生成，观察淫羊藿素对内皮细胞血管生成的抑制作用，并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 淫羊藿素（上海融禾医药科技发展有限公司，批号：100109）和MMT（美国Sigma公司）；沙利度胺（常州制药厂有限公司，批号：国药准字H32026130）；二甲基亚砜（DMSO）（北京亚太精细化工公司产品）；Transwell小室（美国Corning公司）；基质胶（美国Becton-Dickinson公司）；人内皮细胞生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）定量ELISA试剂盒（美国R＆D systems公司）；DMEM培养液（美国Gibco公司）；XDS-1B型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Modle 500型酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司）；人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（中国科学院上海细胞研究所）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含有10%热灭活小牛血清的DMEM培养基在37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度条件下常规培养，2～3 d传代1次，实验用对数生长期细胞。

1.2.2 细胞增殖实验 取对数生长期的人脐静脉内皮HUVEC细胞进行细胞计数，调整细胞浓度为5× 104/m L，以每孔100μL接种于96孔培养板。细胞常规培养24 h后完全贴壁，分别设立空白对照组、实验组、溶剂对照组和阳性对照组，每组设立6个复孔。分别加入0、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L的ICT，0.02%DMSO及100μg/m L的TLD。24 h、48 h后，每孔加入5 mg/m L的MTT溶液，孵育4 h，翻板，每孔加入100μL DMSO。微型混合器上震荡2 min，10 min后于酶标仪检测OD值，波长选择490 nm。按下列公式计算不同浓度淫羊藿素对HUVEC细胞的增殖抑制率：抑制率（%）＝[（空白对照组OD值─实验组OD值）/空白对照组OD值]×100%。

1.2.3 内皮细胞迁移实验 取对数生长期HUVEC细胞，用消化液消化后，加入无血清培养基，吹打制成单细胞悬液，调整细胞密度为9×104个/mL。在24个上室中加入细胞悬液90μl，分为六组，每组4个复孔，每组依次加入药物为0、10-5、10-6、10-7mol/L ICT，0.1%DMSO及500μg/m L的TLD各10μL。在小室下室中各加入含1%胎牛血清的DMEM培养基600 μL。于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育12 h。取出小室，吸弃上下小室的培养基，用棉签擦去膜内表面细胞，然后用PBS液洗2遍。常温下用95%乙醇固定30 min，取出小室风干，用结晶紫染色液染色10 min，最后再用PBS液洗两遍。在100倍光镜下，观察微孔滤膜外表面的细胞，在400倍镜下随机选择5个视野拍照，计得每个视野的细胞数目，取平均值。细胞数目的多少反映内皮细胞的迁移能力，并按下列公式计算迁移抑制率。迁移抑制率＝[1-（实验组细胞的迁移数/空白对照组细胞的迁移数）]×100%。

1.2.4 小管形成实验 用Matrigel胶以每孔120μL包被24孔培养板，铺平后置于37℃培养箱中聚合4 h。取对数生长期HUVEC细胞消化后，将不同浓度ICT、空白对照及TLD与含5%胎牛血清的DMEM培养基，以及HUVEC细胞（5×104/孔，每孔体积为1 m L）混匀后加入24孔培养板。每组4个复孔。于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育24 h。在倒置显微镜下于100倍镜头观察小管形成情况，每孔随即取5个视野拍照，用图像分析软件处理后，以形成的管状结构面积表示ICT的作用强弱。

1.2.5 ELISA检测细胞上清液中VEGF及PEDF的浓度 采用双抗体夹心ABC-ELISA方法，检测人脐静脉内皮细胞HUVEC分泌VEGF及PEDF的水平。取对数生长期HUVEC细胞，常规胰酶及EDTA消化，细胞计数后调整细胞浓度1×105/mL，取100μL接种于96孔培养板，待细胞完全贴壁后，弃原培养基，加入分别含有终浓度为10-6，10-7，10-8mol/L淫羊藿素及50 μg/mL沙利度胺的DMEM培养基250μL，同时设立空白对照组，作用24 h后收集各孔上清液，在4℃条件下，1 000 r/min离心5 min，吸取上清作为待测样品。测定时取200μL上清液，严格按照ELISA试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 淫羊藿素对HUVEC细胞增殖的影响 淫羊藿素对HUVEC的增殖无明显抑制作用，与药物浓度无依赖关系。沙利度胺对HUVEC的增殖存在抑制作用（见表1，图1）。

2.2 淫羊藿素对血管内皮细胞迁移的影响

2.2.1 划痕闭合实验 结果显示，在空白对照组划痕处发生迁移的细胞数目明显多于淫羊藿素各组及沙利度胺组，划痕损伤区重新被内皮细胞覆盖。在淫羊藿素各组中，随着药物浓度的增大，迁移细胞数目逐渐减少，划痕区被细胞重新覆盖的面积也不断缩小。沙利度胺组亦有部分细胞发生迁移，但与空白对照组比较，迁移细胞数目明显减少（见图2）。

表1 ICT对HUVEC细胞株增殖的影响及其抑制率

图1 ICT对HUVEC细胞株增殖的抑制率

图2 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞迁移的影响（×400倍）

2.2.2 Transwell小室趋化实验 结果显示，浓度为10-6～10-8mol/L的淫羊藿素对HUVEC细胞的迁移有明显的抑制作用，并呈浓度依赖关系。与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。浓度为50 μg/mL的沙利度胺也可抑制内皮细胞迁移，迁移抑制率达53.72%，与淫羊藿素中高浓度组比较，组间差异具有统计学意义（P＜0.01），但与淫羊藿素低浓度组比较，两组差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2，图3）。

表2 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞迁移的影响（±s，n＝6）

表2 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞迁移的影响（±s，n＝6）

注：**P＜0.01与空白组比较，△△P＜0.01与沙利度胺组比较。

分组浓度迁移细胞数 迁移抑制率（%）0 41.38±7.78 0沙利度胺组50μg/m L 19.15±6.03**53.72淫羊藿素高浓度组10-6mol/L 4.67±1.26**△△88.71淫羊藿素中浓度组10-7mol/L 10.48±3.15**△△74.67淫羊藿素低浓度组10-8mol/L 21.06±6.83**空白组49.11

图3 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞迁移的影响（×100倍）

表3 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞HUVEC小管形成的影响（±s，n＝6）

表3 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞HUVEC小管形成的影响（±s，n＝6）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与沙利度胺组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组浓度小管面积（um2/field）小管周长（um/field）0 7 883.69±1 034.85 886.61±168.73沙利度胺组50μg/mL 2 933.24±741.43**462.75±161.58**淫羊藿素高浓度组10-6mol/l 5 867.45±925.36**△△734.51±71.57*△△淫羊藿素中浓度组10-7mol/l 1 627.33±288.56**△△249.58±68.25**△淫羊藿素低浓度组10-8mol/l 735.73±325.65**△△132.31±52.73空白组**△△

图4 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞HUVEC小管形成的影响（×100倍）

2.3 淫羊藿素对血管内皮细胞小管形成的影响 光镜下观察结果显示，与空白对照组比较，淫羊藿素各组形成管状结构的数目明显减少，小管间距离增大，管状结构不完整。图像经量化分析后发现，淫羊藿素各组及沙利度胺组管状结构面积和周长明显小于空白对照组（P＜0.01）。沙利度胺组管状面积及周长小于淫羊藿素高浓度组（P＜0.01），但高于淫羊藿素中低浓度组（P＜0.05或P＜0.01）（见表3，图4）。

2.3 淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞 HUVEC分泌VEGF及PEDF的影响ICT和TLD作用于HUVEC 24 h后，ICT和TLD的抑制作用与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。中高浓度淫羊藿素的抑制作用明显强于沙利度胺（P＜0.05或P＜0.01），而低浓度淫羊藿素与沙利度胺比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4）。

表4 淫羊藿素对HUVEC细胞分泌VEGF及PEDF的影响（±s，n＝6）

表4 淫羊藿素对HUVEC细胞分泌VEGF及PEDF的影响（±s，n＝6）

注：*P＜0.05与空白组比较，**P＜0.01 与空白组比较；△P＜0.05与沙利度胺组比较，△△P＜0.01与沙利度胺组比较。

分组浓度VEGF表达量（pg/mL）PEDF表达量（pg/mL）0 1 082.53±18.91 19.31±2.51沙利度胺组50μg/mL 963.77±24.58**23.69±3.18*淫羊藿素高浓度组10-6mol/L 938.43±42.23**25.97±3.65*淫羊藿素中浓度组10-7mol/L 890.45±6.86**△△27.77±3.64*淫羊藿素低浓度组10-8mol/L 861.72±21.34**△△28.28±4.75空白组**△

3 讨论

血管生成是一个由一系列细胞因子介导的级链反应过程，其中血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化是血管生成过程中的关键环节[14]。本研究分别观察了ICT对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的直接效应。我们发现，ICT在10-6～10-8mol/L时对HUVEC细胞的增殖没有抑制作用，表明ICT无细胞毒性作用。研究发现，在浓度10-6～10-8mol/L时，ICT对纤维粘连蛋白诱导的血管内皮细胞的迁移具有抑制作用。在相同浓度下，ICT可降低血管内皮细胞在体外分化成管状结构的能力，这表明血管内皮细胞在形成血管的几个关键环节均不同程度受到ICT的抑制，提示ICT可能通过抑制血管内皮细胞的迁移和分化而发挥其抗血管生成作用。

在血管生成过程中，VEGF是内皮细胞中一种选择性、特异性有丝分裂原，它能够促进内皮细胞进行有丝分裂，提高内皮细胞的生存能力，还能够增强内皮细胞的趋化性和血管壁的通透性。其不仅能够在体内诱发新血管发生，而且在体外还能够促进内皮细胞的增殖，是迄今为止已知的最强的血管生成促进因子之一。PEDF属于丝氨酸蛋白酶超家族，具有高度保守的序列以及独特的分子结构，近年来因研究发现其具有营养神经，抑制新生血管，抗肿瘤等多种功能而成为研究的热点，其中抗新生血管的功能尤为重要[15]。为了探讨淫羊藿素对血管内皮细胞合成和分泌VEGF和PEDF是否有影响，我们检测了血管内皮细胞上清夜中VEGF和PEDF的含量。结果表明，淫羊藿素具有抑制血管内皮细胞分泌VEGF的作用，同时具有促进血管内皮细胞分泌PEDF的作用，而且其作用存在浓度依赖关系。本研究结果说明，淫羊藿素对HUVEC细胞体外构建新生血管具有明显的抑制作用，但它在体内是否也具有抗血管生成效应需要进一步研究发现。

[1]赵国旗，许奕，王蔷.鼻咽癌放射治疗前测定血管内皮生长因子的意义[J].中西医结合学报，2005，3（4）：274-277.

[2]Blagosk lonny MV.Antiangiogenic therapy and tumor progression[J]. Cancer Cell，2004，5（1）：13-17.

[3]叶丽卡，陈济民.淫羊藿的药理研究进展[J].中国中药杂志，2006，25（6）：293-295.

[4]李贵新，张玲.淫羊藿甙诱导白细胞细胞凋亡及其对癌基因表达的影响[J].中华血液学杂志，2002，2（4）：352-353.

[5]李贵新，张玲.淫羊藿苷诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1999，4（3）：235-236.

[6]毛海婷，张玲.淫羊藿甙对高转移肺癌细胞恶性表型的逆转作用及其调控机制研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6（1）：7-8.

[7]赵勇，张玲.淫羊藿甙的体外免疫调节作用研究[J].中草药，1996，27（11）：669-672.

[8]陈逸青，刘从云，孙静，等.淫羊藿总黄酮对丝裂霉素致小鼠骨髓细胞突变的保护作用[J].毒理学杂志，2008，22（5）：368-370.

[9]赵连梅，纪昕，潘晓明，等.淫羊藿苷（ICA）对化疗后免疫抑制小鼠的免疫促进作用[J].中国免疫学杂志，2009，25（12）：1092-1099.

[10]王洪武，贾亮亮，徐媛青，等.淫羊藿总黄酮对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用[J].天津医药，2010，38（12）：1068-1071.

[11]王大伟，邓秀兰，牛建超，等.淫羊藿素和脱水淫羊藿素对人类乳腺癌细胞T47D增殖和细胞周期的影响[J].北京中医药，2009，28（8）：637-640.

[12]叶海勇，刘健，楼宜嘉.淫羊藿苷衍生物的制备及其雌激素样作用研究[J].浙江大学学报：医学版，2005，34（2）：131-136.

[13]吕祥，吴金峰，易婷娇，等.淫羊藿素抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的实验研究[J].中医药导报，2010，16（6）：96-97.

[14]Soff GA.Angiostatin and angiostatin-related proteins[J].Cangcer Metast Rev，2000，19（1-2）：97-107.

[15]Tom bran T ink J，Johnson LV.Neuronaldifferentiation of retinoblastoma cells induced bymedium conditioned by human RPE cells[J].Exp Eye Res，1989，48（4）：549-559.

（2013-11-21收稿 责任编辑：王明）

The Suppressive E ffect of Icaritin on Angiogenesis of Endothelial Cells in Human Um bilical Vein and Its Associated Mechanisms

Lv Xiang1，Feng Yanjun2，Xia Ying1，Liu Jing1，Hou Fenggang1，Li Yan1，Ren Jianlin1，Chen Weijie3
（1 ShanghaiMunicipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200071，China；2 The fifth People's Hospital of Suzhou，Suzhou 215007，China；3 Department of Urology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200071，China）

Objective：To investigate the suppressive effect of Icaritin on angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）and its associated mechanisms.Methods：HUVEC cellswere cultured in vitro，and we observed the effects of Icaritin on its proliferation，migration and tube formation.The content of vascular endothelial growth factor（VEGF）and pigment epithelium-derived factor（PEDF）was detected by ELISA.Results：Icaritin had no significant effect on the proliferation of HUVEC cells after48h treatment.The number ofmigrated cells in Icaritin high concentration group（ICT1 10-6mol/l），middle concentration group（ICT2 10-7mol/l），low concentration group（ICT3 10-8mol/l）and Thalidom ide（TLD）group were 4.67±1.26，10.48±3.15，21.06±6.83，19.15±6.03 respectively，and all ofwhich were lower compared with the control group（41.38±7.78）（P＜0.01）.The area of tube formation in ICT1、ICT2、ICT3 and TLD were separately 5 867.45±925.36，1 627.33±288.56，735.73±325.65，2 933.24±741.43μm2per vision，all of which were lower than the control group（7 883.69±1 034.85μm2per vision）（P＜0.01）.A fter Icaritin treatment，HUVEC cells had a significant lower ability to secret VEGF，but asfor PEDF，itwas on the opposite situation.Conclusion：Icaritin can inhibit the angiogenesis of HUVEC cells in vitro.Such effectmay be related to the decreased activity and synthesis of VEGF in vascular endothelial cells，and also associated with the increased activity and synthesis of PEDF.

Icaritin，Human umbilical vein endothelial cell；Angiogenesis；Angiogenesis inhibitor

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.01.026

国家自然科学基金项目（编号：81173221）；国家中医药重点专科建设项目（编号：ZJ0901ZL020）；上海市中医肿瘤特色专科建设（编号：2008YSZK008）；上海市卫生局科研项目（编号：20124Y018）；上海市教委创新项目（编号：12YZ057）上海中医药大学校级项目（编号：2009050）

吕祥（1979—），男，硕士研究生，住院医师，中西医结合防治肿瘤基础及临床工作，E-mail：xiangzi790812＠126.com