胡立立,杨 蝉,史 蕙*,许乾丽,王 烈
(1.贵阳医学院,贵州 贵阳 550004;2.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;3.贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004)
HPLC-DAD法测定粗粮馒头中6种合成色素
胡立立1,杨 蝉2,史 蕙3,*,许乾丽3,王 烈2
(1.贵阳医学院,贵州 贵阳 550004;2.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;3.贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004)
建立一种简便、快速、重复性好的高效液相色谱-二极管阵列检测器测定粗粮馒头中的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、日落黄、亮蓝6种合成色素的含量。选用无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1,V/V)为样品的提取溶剂,色谱柱为Waters Symmetry®C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,多波长同时测定6种的合成色素,检测波长分别为425、483、520、620 nm。流动相以甲醇为A相,以含0.02 mol/L乙酸铵、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液(pH 4)为B相,进行梯度洗脱。结果表明:6种合成色素均达到基线分离,具有良好的线性关系(r=0.999 9);样品的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、日落黄、亮蓝加标回收率分别为97.94%、96.40%、96.28%、97.63%、98.80%、100.40%,相对标准偏差均小于2.0%。该方法可用于甄别是否由染色而成的粗粮馒头。
高效液相色谱-二极管阵列检测器;粗粮馒头;合成色素;检测
随着经济的发展及人民生活水平的提高,人们对食品的精细度及营养的追求发生着巨大改变,并不局限产品白、细腻及柔软。目前市售的杂粮有玉米、黑米、高粱、谷子、黍子、荞麦、燕麦、大麦及豆类,面粉中掺入了一定杂粮粉制作成杂粮馒头。杂粮馒头中因杂粮粉有着特殊的营养成分,正逐渐被广大消费者接受。但是上海“染色馒头”事件的发生,证实目前一些不法商贩为了谋取利润,在面粉中添加合成色素冒充玉米、高粱、荞麦等杂粮馒头。伪造玉米、高粱、荞麦、燕麦馒头可能由黄色、红色、蓝色等几种合成色素调制而成。常用的黄色色素有柠檬黄和日落黄,常用的红色色素有苋菜红、胭脂红和诱惑红,常见的蓝色色素有亮蓝。人体过量的摄入合成色素后会在体内蓄积分解成致突变原前体芳香胺类化合物,有些甚至可能转化形成致癌物质,对食用者的健康危害极大[1-4]。依据我国GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》中对柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝6种合成色素的允许使用品种、使用范围以及最大使用量(或残留量)作出了明确规定。这6种合成色素可用作糕点表面的彩装,但禁用于主食食品中。而使用合成色素掺假、伪造粗粮馒头是典型的对消费者欺诈行为。目前我国国标[5-7]中测定合成色素的方法主要有薄层色谱法[8-9]、高效液相色谱法[10-22]、示极波谱法[23-24]和分光光度法[25-26]。因此建立简便、快捷、准确的分析方法检测馒头中的合成色素具有重要意义。本实验旨在建立同时测定粗粮馒头中6种合成色素的检测方法。
1.1 材料与试剂
粗粮馒头(生产批号:130106、130108、130119、130398、130565、130566、130625、130710、130830、130885)来源于贵州省食品药品检验所。
甲醇(色谱纯) 美国Tedia试剂公司;乙酸铵(色谱纯) 美国Mreda公司;冰醋酸(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;氨水(分析纯) 重庆川东化工(集团)有限公司;三乙胺(分析纯) 成都市科龙化工试剂厂;柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝6种合成色素标准品 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A液相色谱仪(LC solution色谱工作站、二极管阵列检测器) 日本岛津公司;TGL6-ws台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;BT2202S电子分析天平 德国Sanorius公司;KQ5200DE型超声波清洗器 江苏昆山市超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱分析条件
色谱柱:W a t e r s S y m m e t r y®C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测波长:425、483、520、620 nm;柱温:35 ℃;流动相以甲醇为A相,以含0.02 mol/L乙酸铵溶液、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液(pH 4)为B相,进行梯度洗脱程序;流速:1.0 mL/min。柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、日落黄、亮蓝6种合成色素的理论塔板数分别为18 275.21、24 463.96、71 780.31、118 230.44、88 358.43、226 193.51;拖尾因子数分别为1.20、1.36、124、1.16、1.18、1.17。
表1 6种合成色素的较佳洗脱梯度程序Table1 Optimal elution conditions for six kinds of synthetic pigments by HHPPLLCC
1.3.2 标准贮备溶液
分别精密称取柠檬黄对照品(批号90813,含量90.0%)0.010 59 g、苋菜红对照品(批号20291,含量99.0%)0.010 33 g、胭脂红对照品(批号91120,含量70.0%)0.014 13 g、诱惑红对照品(批号80917,含量83.0%)0.012 46 g、日落黄对照品(批号91001,含量87.0%)0.011 32 g、亮蓝对照品(批号20705,含量82.1%)0.010 97 g分别置100 mL量瓶中,以水溶解并定容至刻度,摇匀,制得相应质量浓度分别为95.31、102.27、98.91、103.42、98.48、98.27 øg/mL的标准贮备溶液。
1.3.3 混合标准使用溶液
分别精密吸取柠檬黄标准贮备溶液5 mL、苋菜红标准贮备溶液8 mL、胭脂红标准贮备溶液8 mL、诱惑红标准贮备溶液8 mL、日落黄标准贮备溶液15 mL、亮蓝标准贮备溶液5 mL至50 mL量瓶中,制得相应质量浓度分别为9.73、16.70、16.15、16.88、30.15、10.03 øg/mL的混合标准使用溶液。
1.3.4 样品供试溶液的制备
试样处理:取50 g样品,用刀切碎成碎末,称取约20 g,置食物粉碎机中,打碎成粉末(过40目筛),作为供试样品。
称取供试样品4.00 g(准确至0.01g),置100 mL量瓶中,加入无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)溶液约80 mL,置超声波中超声30 min,取出,放置室温,用无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)溶液定容,摇匀,取上清液滤过,弃去约10 mL初滤液,精密吸取续滤液50 mL置蒸发皿中,水浴蒸至近干,以水溶解残渣并转移至5 mL量瓶中,以水定容,摇匀。转移至离心管中,5 000 r/min离心5 min,取上清液作为样品供试溶液。
1.3.5 模拟样品供试溶液的制备
通过多次模拟试验,当面粉中含柠檬黄2.45 mg/kg、日落黄7.73 mg/kg、苋菜红3.88 mg/kg、胭脂红4.02 mg/kg、诱惑红4.04 mg/kg、亮蓝2.37 mg/kg混匀后的样品与市售高粱、荞麦馒头颜色相似。故选择该样品为模拟供试样品。根据1.3.4节操作步骤制备成模拟样品供试溶液。
2.1 色谱峰的归属
根据1.3.1节色谱条件,获得对照品混标溶液及模拟阳性样品溶液色谱图见图1、2。
图1 6种合成色素标准物质混标Fig.1 HPLC chromatogams of mixed standards of synthetic pigments
图2 模拟阳性样品色谱图Fig.2 HPLC chromatogams simulated positive sample
2.2 混标标准曲线和检出限
分别吸取1.3.3节标准使用溶液1、3、5、7、9、10 mL置10 mL量瓶中,得到一系列相应质量浓度,进样10 øL于高效相色谱分析。以各组分进样量(ng)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制线性关系图,得回归方程。以信噪比法(RSN=3)考察6种色素的最低检出限。可见6种色素在其一定质量浓度范围内呈良好的线性关系。结果见表2。
表2 6种合成色素的线性方程、相关系数及检出限Table2 Linear equations and limits of detection (LLOODD) for siixx kinds of synthetic pigments
2.3 精密度和回收率
准确称取模拟阳性样品4.00 g(准确至0.01 g)添加色素标准品量分别为柠檬黄2.43 mg/kg、日落黄7.53 mg/kg、苋菜红4.17 mg/kg、胭脂红4.04 mg/kg、诱惑红4.22 mg/kg、亮蓝2.51 mg/kg。根据1.3.4节试样测定步骤进行测定,平行测定6次,计算回收率及相对标准偏差。由表3可见,6种合成色素的回收率在96.28%~100.40%,相对标准偏差在0.90%~1.90%之间。
表3 6种合成色素的回收率、精密度(n==66)Table3 Recoveries and RSDs of six kinds of synthetic pigments from spiked sampleess ((nn == 66))
2.4 实际样品的测定
应用本研究建立的方法对10批不同批号的粗粮馒头产品中的6种合成色素进行测定,进样体积为20 øL,结果见表4。
表4 粗粮馒头中6种合成色素含量的检测Table4 Contents of six kinds of pigments in commercial steamed breads of coarse grains as determined by this method mg/kg
2.5 供试样品提取方法的选择
2.5.1 提取溶剂的选择
合成色素是水溶性化合物,因此在试验过程中分别考察水、无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)两种提取溶剂对6种合成色素进行考察,结果发现水作为提取溶剂的各合成色素的回收率远远低于无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1),故选用无水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)来提取样品中的合成色素。
2.5.2 提取方法的选择
目前对于合成色素的提取方法大多数选择是聚酰胺吸附法,也是GB/T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》中所采用的。但是在试验过程中发现实际样品中杂质较少,基本无杂质干扰峰。就此而言采用聚酰胺吸附法是既耗时又浪费试剂,而且操作步骤繁琐。在试验过程中比较了超声提取和聚酰胺吸附法两种方法,结果表明前者的回收率和精密度都比后者好。同时需要注意的是混合纤维素脂膜对合成色素具有吸附作用从而影响回收率。故最后选择超声提取30 min后滤过在弃去10 mL初滤液后在收集提取液,水浴挥干,以水定容后离心取上清液进样。
2.6 检测波长的选择
使用紫外分光光度计分别对诱惑红、柠檬黄、日落黄、苋菜红、亮蓝、胭脂红进行光谱扫描,结果见图3。
图3 6种合成着色剂标准品的紫外光谱扫描图Fig.3 UV-Visible spectra of six kinds of synthetic pigments
由图3可以得出,6种合成色素在254 nm波长附近处都有较强吸收,但样品中的杂质在其相应处同样有吸收,干扰极大,甚至会导致误识,影响检测结果。因此排除末端吸收,确定了柠檬黄的测定波长为425 nm,日落黄的测定波长为483 nm,苋菜红、胭脂红和诱惑红的测定波长为520 nm,亮蓝的测定波长为620 nm。较GB/T 5009.35—2003的测定第一法中选定的254 nm基线平稳,目标物能够得到有效分离,且实际样品无干扰峰。
2.7 色谱柱与流动相的选择
在试验过程中分别对Waters X-Bridge phenyl(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil GoLd Dima(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil ODS2(5.0 mm×150 mm,5 μm)及Waters Symmetry®C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)对6种合成色素分离的效果进行考察。并且在实验中发现依据GB/T 5009.35—2003中梯度洗脱程序标样中的一些色素峰分离不完全。对甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液不同时间梯度洗脱对各组分的分离效果进行比较,发现各组分的峰形存在拖尾现象;胭脂红和日落黄未完全分开;亮蓝未完全分离的现象。故在水相中加入适量的三乙胺和冰醋酸,最后确定以Waters Symmetry®C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱,甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液(pH 4)梯度洗脱时间如表1所示。各组分的分离度大于1.5,分离度较好。
本研究采用高效液相色谱法测定粗粮馒头中6种合成色素的含量,在样品的前处理技术和色谱条件进行了简化,减少样品分析繁琐的实验步骤,提高了操作的简便快捷性。从线性范围、回收率、精密度等方面进行考察,证实6种合成色素在本色谱条件下分离效果好、回收率高。且适合粗粮馒头中合成色素的含量的检测。通过对实际样品的检测结果来分析,可知目前市售的粗粮馒头的质量参差不齐,存在着添加合成色素以假乱真的现象,对人民的饮食健康存在着安全隐患。
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Determination of Six Kinds of Synthetic Pigments in Chinese Steamed Bread of Coarse Grains by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection
HU Li-li1, YANG Chan2, SHI Hui3,*, XU Qian-li3, WANG Lie2
(1. Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 3. Institute for Food and Drug Control of Guizhou Province, Guiyang 550004, China)
A high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) method for determining the synthetic pigments tartrazine, amaranth, carmine, temptation, sunset yellow and bright blue in Chinese steamed bread of coarse grains with simple pretreatment, high sensitivity and good repeatability was proposed in this study. Samples of steamed bread were extracted with a mixture solvent composed of absolute ethanol, ammonia water and pure water (7:2:1, V/V) and the extracts were separated on a Waters Symmetry®C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. HPLC chromatograms were detected at 425, 483, 520 and 620 nm, respectively. Mobile phase A was methanol and mobile phase B consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate, 1% acetic acid and 0.2% triethylamine in water (pH 4). A gradient elution program was used. Baseline separation was achieved for all six kinds of synthetic pigments, providing a good linear relationship (r = 0.999 9). The recoveries from spiked samples for tartrazine, amaranth, carmine, temptation, sunset yellow and bright blue were, respectively, 97.94%, 96.40%, 96.28%, 97.63%, 98.80% and 100.40% with RSD less than 2.0%. This method is useful to discriminate undyed from dyed steamed breads of coarse grains.
high performance liquid chromatographic with diode array detection (HPLC-DAD); Chinese steamed bread; synthetic pigments; detection
TQ617.1;O657.72
A
1002-6630(2014)02-0222-05
10.7506/spkx1002-6630-201402043
2013-09-11
贵州省科技厅科技计划课题(黔科合SY字[2011]3090号);贵州省食品、保健食品和化妆品监测检测平台课题(黔科平台[2012]4001号);国家食品药品监督管理局研究课题
胡立立(1986—),男,硕士研究生,研究方向为食品药品质量控制关键技术。E-mail:540217252@qq.com
*通信作者:史蕙(1962—),女,副主任药师,硕士,研究方向为药品质量。E-mail:Shihui169@126.com