Alcalase协同强化高温风干成熟工艺对狼山鸡蛋白质水解的影响

赵见营，唐 静，吴海舟，张迎阳，章建浩,*

（1.南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，教育部肉品加工与质量控制重点实验室，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.南通双和食品有限公司，江苏 南通 226352）

Alcalase协同强化高温风干成熟工艺对狼山鸡蛋白质水解的影响

赵见营1，唐 静1，吴海舟1，张迎阳2，章建浩1,*

（1.南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，教育部肉品加工与质量控制重点实验室，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.南通双和食品有限公司，江苏 南通 226352）

以南通狼山鸡为原料，采用碱性蛋白酶（Alcalase）酶解结合强化高温风干成熟工艺制作风鸡，以游离氨基酸总量（åFAA）、蛋白质水解指数为响应指标，采用响应曲面试验方法分析Alcalase协同强化高温风干成熟工艺对狼山鸡蛋白质水解的影响，并优化狼山鸡强化高温风干成熟工艺。结果表明：Alcalase能显著促进原料的蛋白质水解，鸡肉中åFAA随着Alcalase添加量与强化高温温度提高而显著提高；Alcalase添加量与强化高温温度和风干温度对åFAA有显著的交互作用（P＜0.05）；在控制蛋白质水解指数小于11%的前提下，得到Alcalase酶解风干狼山鸡的优化工艺为强化高温温度46 ℃、酶添加量1.88 U/g、风干成熟起始温度14.5 ℃，风干狼山鸡的åFAA为2.02 g/100 g，蛋白质水解指数为10.42%。说明Alcalase酶解协同强化高温风干成熟工艺能有效促进狼山鸡蛋白质水解，提高风味品质。

狼山鸡；强化高温风干成熟；碱性蛋白酶；蛋白质水解；交互作用

腌腊风干禽肉制品因其传统风味品质特色而受到消费者的青睐，而腌制风干成熟工艺成为其品质控制的关键[1]。强化高温成熟工艺是对传统风干成熟工艺的现代化改造，实验证明，高温成熟能有效促进畜禽肉中蛋白质水解游离氨基酸生成和风味形成，显著缩短发酵成熟工艺的延续时间，提高生产的效率，适合腌腊肉制品现代规模化生产[2-3]。研究[4-5]表明高温成熟工艺可以提高酶活，加快蛋白分解和美拉德反应的速度，从而促进风味物质的形成，缩短风干成熟时间。

各种风干禽肉制品在其加工过程中，蛋白质都发生不同程度的降解，产生分子质量不等的肽类和游离氨基酸。部分游离氨基酸还通过Strecker降解，产生醛类和酮类等化合物[6]，这些物质构成了干腌火腿的重要风味成分。蛋白质酶解是指蛋白质在酶的作用下降解成肽类或更小分子质量的氨基酸的过程[7]，是改造蛋白质、提高蛋白质价值的最有效途径之一，并且酶解条件温和、产物安全性高、营养价值高、易消化、易与其他风味物质搭配，已成为当今蛋白质领域最大的发展方向之一[8-11]。酶解技术在鸡禽领域的应用主要是肉的嫩化（如木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味酶等[12-14]）以提高风味、口感亦或是应用到肉中副产品中（如碎肉、鸡骨、鸡头、鸡杂等[15-17]）提高肉资源的利用率。碱性蛋白酶（Alcalase）是一种专一性较弱的内切酶，其作用位点有多种：Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp，可用于鸡肉蛋白的深度酶解[18-19]。狼山鸡是我国著名的肉蛋兼用型地方鸡种[20]，狼山鸡的平均日龄为300～365 d，具有肉质鲜美、浓郁的特点，其蛋白质含量约为23%，与普通鸡肉相比蛋白质含量丰富，但嫩度较差[21]。本实验以狼山鸡为原料，在风鸡加工中引入Alcalase外源蛋白酶，并组合强化高温改变加工风鸡产品。利用Design Expert设计响应曲面，优化风鸡加工工艺，以期为狼山鸡及其他禽类风干产品的开发提供理论依据及技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狼山鸡（鸡龄365 d） 南通双和食品有限公司；食盐 市售；Alcalase 2.4 L（酶活力＞200×104U/g）丹麦诺维信公司；消化片（5.5 g硫酸钾和0.5 g无水硫酸铜） 丹麦Foss公司；三氯乙 酸、硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、盐酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

氨基酸自动分析仪 日本日立公司；Allegra 64R型高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；2300型KjeltecTM自动凯氏定氮仪、KDN-04消化炉 丹麦Foss公司；SPX-250C型恒温恒湿箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

实验组：狼山鸡→前处理→取鸡胸→腌制→酶解→高温风干→成品。

对照组：狼山鸡→前处理→取鸡胸→腌制→高温风干→成品。

操作要点：预处理：宰杀适龄狼山鸡、放血、拔毛、去内脏、洗净鸡体、沥干水分，保留鸡皮的分割鸡胸肉；腌制（m/m）：取3%食盐均匀地涂在样品的表面；酶解：根据实验设计分别注射质量分数为0.002% Alcalase溶液，通过不同体积注射，使酶活力在鸡肉中分别为1、2、3 U/g，注射完毕后按摩鸡肉促进酶液均匀扩散；风干成熟：将酶解后的鸡胸肉置入恒温恒湿箱中，根据实验设计预先强化高温1 h[4]，分别在不同风干温度进行风干，风干升温程序为温度1 ℃/6 h，相对湿度在58%～62%，风干时间为72 h。取风干成熟后的样品，剔除可见脂肪和肌膜，－20 ℃贮藏。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 蛋白质水解指数测定[22]

总氮（total nitrogen，TN）测定：样品解冻绞碎后，称取1 g（精确到0.001 g）于消化管中，加12 mL浓硫酸及1片消化片于消化管中，420 ℃消化1.5 h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定TN。

非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）测定：样品解冻绞碎后，取5 g（精确到0.001 g）加入质量分数10%三氯乙酸25 mL，高速分散器匀浆3次（5 000 r/min，20 s/次），4 ℃放置过夜，冷冻离心（5 000×g、4 ℃、5 min），过滤，取滤液于消化管中，加5 mL浓硫酸于220 ℃烘水1 h，再加硫酸7 mL，420 ℃消化1.5 h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定NPN。蛋白质水解指数（proteolysis index，PI）按式（1）计算。

1.3.2.2 游离氨基酸总量（total free amino acid，åFAA）测定

参考Virgili等[23]方法，略作修改：准确称取样品6.00 g，加入60 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5），匀浆（6 000 r/min、3 min），离心（10 000×g、4 ℃、20 min），取上清液0.5 mL，用3%水杨酸溶液调节pH值至2.0，加入0.25 mL双蒸水，离心（15 000×g、4 ℃、20 min），取上清液0.5 mL，使用0.02 mol/L盐酸稀释5～10倍，用氨基酸自动分析仪检测，ΣFAA结果以干基计算。检测条件：洗脱液为柠檬酸缓冲液（pH 3.3～4.9），显色液为茚三酮：乙二醇甲醚-乙酸钠缓冲液（2.75∶25，V/V），除羟脯氨酸在440 nm波长处检测外，其余氨基酸均在570 nm波长处检测。

1.3.3 单因素试验设计

固定酶添加量2 U/g、风干起始温度12 ℃，在强化高温分别为35、40、45、50、55、60 ℃时按工艺流程制作风干狼山鸡，并测量åFAA和PI；固定风干起始温度12 ℃、强化高温45 ℃，在酶添加量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 U/g时按照工艺流程制作风干狼山鸡，并测量åFAA和PI；固定酶添加量2.0 U/g、强化高温45 ℃，在风干起始温度为4、8、12、16、20 ℃时按工艺流程制作风干狼山鸡，并测量åFAA和PI。

1.3.4 响应曲面设计

采用软件Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken模式进行响应曲面试验设计，以åFAA和PI为指标，强化高温、酶添加量、风干起始温度作为主要的考察因素（自变量）分别以X1、X2、X3表示，综合单因素试验结果，其取值范围并确定为：强化高温35～55 ℃、酶添加量1.0～3.0 U/g、风干起始温度8～16 ℃。试验因素水平设计见表1。

表1 试验自变量因素编码及水平Table1 Codes levels for factors used in Box-Behnken experimental design

1.4 数据统计分析

所有数据利用Microsoft Excel进行统计处理，用SAS 9.2进行ANOVA分析，不同平均值之间利用LSD法进行差异显著性检验。用Design Expert 8.0.6建立响应曲面回归方程，响应曲面试验结果利用最小二乘法进行二次多项式回归统计分析，其基本模型见式（2）：

式中：β0、βi、βii和βij代表回归系数；Xi和Xj代表不同的自变量；Y代表响应变量。

2 结果与分析

2.1 单因素对游离氨基酸总量和蛋白质水解指数的影响

图1 强化高温对∑FAA和PI的影响Fig.1 Effect of intensifying high temperature on ∑FAA and PI

由图1可知，随着强化温度的升高，åFAA呈先降低后升高的趋势，在45 ℃附近出现转折点，在一定温度范围内PI与其规律大致相同，可能的原因是酶活力随着温度的升高先升高后降低，但当温度大于55 ℃后，蛋白水解急剧上升，可能的原因是高温破坏了蛋白质内的二硫键或使蛋白变性。

图2 酶添加量对∑FAA和PI的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on ∑FAA and PI

由图2可知，随着酶添加量的增加，åFAA和PI都是呈上升趋势，在酶添加量多于3 U/g时PI大于11%。

图3 风干起始温度对∑FAA和PI的影响Fig.3 Effect of air-drying temperature on ∑FAA and PI

由图3可知，随着风干起始温度的升高，åFAA呈现先降低后升高的趋势，在温度高于16 ℃时该值降低，主要的原因可能是是风干过程中温度太高促进了Strecker降解，降低了游离氨基酸的含量，PI在这一过程中一直呈现上升趋势，当风干起始温度在20 ℃时该值为12.47%。

2.2 响应曲面优化试验

以游离氨基酸总量（Y1）和蛋白质水解指数（Y2）为响应值试验结果见表2。

表2 响应曲面试验设计与结果Table2 Response surface experimental design and results

2.3 回归模型建立及显著性分析

利用Design Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行二次多项式回归分析，建立åFAA对3个响应因素的二次多项式的回归方程：

表3 ∑FAA回归模型系数显著性检验Table3 Significance test of the regression coefficients in the ∑FAA model

为了验证建立的回归模型是否显著，对模型进行方差分析，结果如表3所示。模型的显著性及失拟性检验结果、模型决定系数值的大小以及信噪比的大小等可进行综合评定回归模型的精确度。表3中结果表明，本回归模型的显著性（F检验）检验结果极显著（P=0.000 1）、失拟性检验结果不显著（P=0.164 3＞0.05），说明该二次模型能够拟合真实的试验结果。该模型决定系数（R2）与模 型校正决定系数（）分别为0.971 0和0.933 7、模型信噪比为14.283大于临界值4。综上结果，说明该模型拟合效果良好，试验误差小，可信度高。因此该模型可以用于风鸡加工工艺优化。

回归模型中各项对åFAA的的影响分别为：在所有一次项中强化高温（X1）、风干起始温度（X3）对结果有极显著影响（PX1=0.000 1，PX2=0.000 4），酶添加量（X2）对结果影响显著（PX3=0.031 4）；所有二次项对åFAA的影响都是极显著的；在交互项中，存在强化高温和酶添加量以及酶添加量与风干起始温度的交互作用对åFAA的结果有显著影响（PX1X2=0.023 1，PX2X3=0.036 0），强化高温和风干起始温度对结果无显著交互作用。以上这些试验因素对åFAA的影响情况表明，在风鸡强化高温风干成熟过程中，酶添加量对åFAA有着非常重要的影响，且影响是非线性的，由于在风鸡实际加工过程中，各工艺因素往往是同时起作用，因此研究其交互作用对指导实际生产有重要意义。

2.4 试验因素交互作用分析

2.4.1 强化高温和酶添加量对åFAA交互作用的影响

从图4等高线图的近似椭圆可得出，强化高温和酶添加量对åFAA有明显的交互作用。随着强化高温在取值范围内的升高，åFAA一直在呈先升后降的趋势，但酶添加量临界值呈缓慢上升规律，当强化温度到45 ℃时，在蛋白水解指数小于11%时，酶添加量的临界值在1.1 U/g左右。可能的原因是在35～45 ℃范围内，内、外源蛋白酶随着温度的升高，活力上升，åFAA增加；随着温度继续上升，过高的温度抑制了酶的活力，蛋白酶解降低，造成åFAA的降低。具体关于强化温度对酶添加量临界值的影响见表4。

图4 强化高温和酶添加量对∑FAA交互影响的响应曲面及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect between intensifying high-temperature and enzyme dosage on ∑FAA

表4 不同强化高温条件下酶添加量对∑FAA影响的临界值Table4 The critical values for enzyme dosage under different intensifying high-temperatures

表4为固定风干起始温度，取不同强化高温得到的酶添加量取值，表中反应的酶添加量临界值趋势与图1基本一致，都是随强化温度的升高逐渐增大。将表中两因素的取值作线性回归分析，可以看出二者呈线性关系（X2=0.014 1X1＋0.456 3，R2=1），另外，随强化高温变化的åFAA临界值呈现先上升后下降的趋势，在温度达到50 ℃时出现最大值。

对于强化高温临界值的变化，当酶添加量在1～3 U/g时，强化高温的临界值呈一直上升趋势，当控制蛋白水解指数小于11%，酶添加量为2 U/g时，强化高温临界值可达到55 ℃，显然，酶添加量的增加促进了鸡肉蛋白的水解。具体强化高温临界值的变化见表5，对表5强化高温临界值随酶添加量的变化进行线性回归分析，结果（X1=4.54X2＋44.73，R2=0.99）表明强化高温对åFAA影响的临界值随酶添加量的增加呈上升趋势，并且随酶添加量变化的åFAA临界值呈现先下降后上升的趋势，在酶添加量为1.5 U/g时，出现最大值。由于在风干狼山鸡的生产中风干前的强化高温和酶活力对åFAA有显著的影响，因此以上实验结果可以在狼山鸡风鸡的开发中实现对其品质的调控。

表5 不同酶添加量条件下强化高温对∑FAA影响的临界值Table5 The critical values for intensifying high-temperature under the different enzyme dosages

2.4.2 酶添加量和风干起始温度对åFAA交互作用的影响

当固定强化高温为45 ℃时，酶添加量和风干起始温度之间对åFAA的交互作用如图5所示，在等高线中表现出的椭圆说明，两因素对试验结果有显著的交互作用，表现为åFAA随某一因素的增大呈现先升后降的规律。可能的原因是，在一定的风干起始温度和酶添加量的范围内，在酶的作用下，蛋白质逐渐水解为游离氨基酸，但随着风干过程的继续和风干起始温度的升高，美拉德反应和Strecker降解的逐渐加快，导致åFAA的降低。两因素间的相互作用关系表现在随酶添加量的增加，风干起始温度的临界值逐渐下降；而随着风干起始温度的升高酶添加量的临界值也逐渐降低。

从图5可以看出，当酶添加量在2.0 U/g时，风干起始温度的临界值在12 ℃左右，此后随着酶添加量的增加或风干起始温度的升高，åFAA逐渐降低。影响åFAA的风干起始温度的临界值随酶添加量的变化见表6，表中显示，酶添加量增加后，风干起始温度临界值逐渐降低；对二者做线性回归分析后得出，二者呈线性负相关，且风干起始温度的临界值以酶添加量每增加0.5 U/g降低约1 ℃（X3=－1.94X2＋15.66，R2=0.99），åFAA临界值随酶添加量的增加呈下降趋势。

当风干起始温度为12 ℃时，酶添加量的临界值在1.1 U/g左右，此处åFAA存在最大值，与前面强化高温和酶添加量对其交互作用的研究结果有良好的一致性。不同风干起始温度对酶添加量临界值的影响见表7，从表7可看出，当风干起始温度为8 ℃时，酶添加量临界值为1.219 U/g，当风干起始温度上升到16 ℃时，酶添加量降低到0.966 U/g，在此基础上对其做线性回归分析，可明显的看出风干起始温度和酶添加量的临界值呈线性负相关（X2=－0.031 7X3＋1.472，R2=1），åFAA临界值随风干起始温度的升高呈现先升后降的趋势，在风干起始温度为14 ℃时有最大值。

图5 酶添加量和风干起始温度对∑FAA交互影响的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effect between enzyme dosage and air-drying temperature on ∑FAA

表6 不同酶添加量条件下风干起始温度对∑FAA影响的临界值Table6 The critical values for air-drying temperature under different enzyme dosages

表7 不同风干起始温度条件下酶添加量对∑FAA影响的临界值Table7 The critical values for enzyme dosage under different air-drying temperatures

2.5 酶解风干成熟工艺优化

在风干肉制品中，当蛋白水解指数超过11%时，肉质开始变软，并影响外观和口感[22]，因此在控制蛋白质水解的前提下，以终产品中åFAA最大值为目标，控制PI小于11%，利用Design-Expert软件自带的结果优化程序对风干狼山鸡酶解强化高温成熟工艺进行优化，得到最优工艺条件为强化高温45.93 ℃、酶添加量1.88 U/g、风干起始温度14.33 ℃，此条件下åFAA理论值为1.99 g/100 g，PI为10.3%。采用该优化条件进行风鸡生产，依据生产实际稍作调整，取强化高温46 ℃、酶添加量1.88 U/g、风干起始温度14.5 ℃，测得åFAA为2.02 g/100 g，PI为10.42%（n=3），相对误差小于5%，因此该工艺准确可靠，可用于酶解风干狼山鸡的生产。

3 结 论

通过响应曲面试验结果可以得到，Alcalase能显著促进原料的蛋白质水解，鸡肉中åFAA随着 Alcalase添加量增加与强化高温升高而显著提高；Alcalase添加量与强化高温和风干起始温度对终产品中åFAA有显著的交互作用（P＜0.05）；通过响应曲面优化法得到Alcalase酶解狼山鸡通过强化高温生产风鸡的最优工艺为强化高温46 ℃、酶添加量1.88 U/g、风干起始温度14.5 ℃。验证实验表明，在此实验条件下得到的åFAA为2.02 g/100 g，PI为10.42%，可以较好地预测产品中游离氨基酸的含量。

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Proteolysis in Dry-Cured Langshan Chicken as Influenced by Alcalase Combined with Intensifying High-Temperature Air-Drying

ZHAO Jian-ying1, TANG Jing1, WU Hai-zhou1, ZHANG Ying-yang2, ZHANG Jian-hao1,*
(1. National Center of Meat Quality and Safety Control, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Key Laboratory of Food Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Nantong Shuanghe Food Company, Nantong 226352, China)

In this study, alcalase was applied before the air-drying step in the manufacture of dry-cured breast meat from Nantong Langshan chicken. The influence of alcalase combined with air-drying ripening on proteolysis in dry-cured chicken as evaluated by total free amino acid (åFAA) proteolysis index (PI) was analyzed by response surface methodology. Three operating parameters including enzyme dosage, initial temperature and intensifying temperature were optimized using Box-Behnken experimental design. Based on the models established, alcalase significantly promoted protein hydrolysis in the raw material and the level of åFAA was increased significantly with increasing enzyme dosage and intensifying high-temperature. An interaction between enzyme dosage and air-drying temperature or intensifying high-temperature significantly influenced åFAA (P ＜ 0.05). The optimum levels for enzyme dosage, initial temperature and intensifying temperature were determined to be 1.88 U/g, 14.5 ℃ and 46 ℃, respectively. A PI of 10.42% and a ∑FAA of 2.02 g/100 g were obtained under these conditions.

Langshan chicken; intensifying high-temperature air-drying; Alcalase; proteolysis; interaction

TS251.55

A

1002-6630（2014）02-0030-06

10.7506/spkx1002-6630-201402006

2013-01-19

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B01）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；南通市农村科技创新及产业化项目

赵见营（1988—），男，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：callfull@163.com

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工包装与质量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn