人参皂甙Rb1对环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠的保护作用

唐忠艳 姜 薇 李秀明 黄秋思 赵海花 赖 红＊

（1中国医科大学基础医学院人体解剖学教研室，沈阳110001；2沈阳市浑南新区妇产科，辽宁110180）

近年来由于恶性肿瘤的年轻化趋势，免疫性疾病好发于年轻女性以及化疗后患者存活率不断提高等现象，使化疗所致卵巢早衰成为临床关注的热点［1］。化疗对卵巢有严重损害，烷化剂较易引起卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）［2］。妇女卵巢早衰后，由于卵泡闭锁，卵泡数量的急剧减少，导致卵巢功能急剧减退。如果补充体内缺失的雌激素可明显改善卵巢早衰的症状，激素替代疗法虽然临床疗效确切，但其副作用较大，使其应用受到一定的限制。

人参作为传统的抗衰老药物，其有效活性成分是人参皂甙（ginsenoside，GS），GS由几十种单体成分组成，其中人参皂甙Rb1的含量高、作用广、活性强。在美国将人参作为能减轻绝经期症状的中草药被推荐使用，现已证实Rb1具有雌激素样活性。但是国内外对人参皂甙Rb1在妇产科疾病方面的研究较少，关于人参皂甙Rb1对化疗致卵巢早衰大鼠卵泡颗粒细胞Bcl－2及Bax蛋白表达影响的研究尚未见文献报道。因此，本研究拟采用免疫组织化学和免疫印迹方法探讨化疗致卵巢早衰大鼠Bcl－2和Bax的蛋白表达，同时探讨人参皂甙Rb1对卵巢保护作用，为卵巢早衰患者的临床治疗奠定理论基础。

材料和方法

1．实验动物及分组

选用中国医科大学实验动物部提供的雌性2－3月龄，体重200±20g，具有正常动情周期的wistar大鼠30只，适应性饲养1周后，随机分为3组，每组10只：①对照组：不施加任何处理因素；②模型组：腹腔注射环磷酰胺负荷剂量50mg／kg，以8mg／kg／d的维持剂量连续注射14d，之后给予等剂量的生理盐水灌胃，连续4周；③治疗组：造模成功后，给予人参皂甙 Rb1 25mg／kg／d灌胃，连续4周。

2．主要试剂与仪器

Bcl－2抗体、Bax抗体（北京博奥森公司），FSH、E2放免试剂盒（北京博奥森公司），全蛋白提取试剂盒（凯基公司），冰冻切片机（leitz，德国），凝胶成像仪、电泳仪（上海天能科技有限公司），康氏振荡器（KS－Ⅱoscillator），高速台式冷冻离心机（TGl－16）。

3．灌流及取材

各组大鼠用10%水合氯醛3．5ml／kg腹腔注射麻醉后，开胸暴露心脏，左心室插管，灌注生理盐水约150ml后，再灌注4%多聚甲醛（0．1MPB，pH 7．4）250ml，持续30min后立即取卵巢，卵巢组织在相同缓冲液中后固定3－24h，经30%蔗糖缓冲液48h，OCT包埋，行恒冷箱冰冻切片。

4．免疫组织化学染色方法

卵巢组织6μm厚连续切片。采用SABC法行免疫组化染色，卵巢组织切片常温干燥，30%H2O220ml加蒸馏水200ml混合，室温10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗5min×3次；用微波炉进行热修复抗原后；用5%BSA封闭液室温封闭30min；分别滴加Bcl－2和Bax一抗（1∶200）4℃过夜；翌日，室温下滴加生物素化山羊抗兔IgG作用10min，再滴加SABC作用30min；DAB显色3－10min，苏木素复染，自来水返蓝15min；常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

5．Western blot方法

每组各取4只大鼠颈椎脱臼处死、断头、剥离并取出双侧卵巢，将其剪碎加入0．5ml裂解液，冰上放置30min匀浆，4℃12000g／min低温离心30min，取上清。BCA法进行蛋白定量，计算样品蛋白浓度。加上样缓冲液，水浴煮沸5min，冰上冷却。等量上样后进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳行，4%浓缩胶（80v，30min），12%分离胶（120v，50min），然后湿转到PVDF膜上（60v，2h），5%脱脂奶粉（用 TTBS配制）室温封闭1h，分别加一抗Bcl－2和Bax抗体（1∶200）和β－actin抗体（1∶200）4℃冰箱过夜，TTBS洗膜10min×3次，分别与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG（1∶5000）室温下孵育1h，TTBS洗膜10min×3次，将PVDF膜置于保鲜膜上，A、B发光液按1∶1比例混合，滴加A、B混合液，进行发光，经凝胶自动分析成像系统进行成像，图像采集和分析。

6．统计学分析

以上所得数据以均数±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS11．5软件单因素方差分析进行组间比较。P＜0．05为有统计学意义，P＜0．01为有显著统计学意义。

结 果

1．卵巢颗粒细胞Bax蛋白的表达

免疫组化SABC法镜下观察到卵巢组织内的Bax阳性反应产物呈棕褐色细颗粒状，主要积聚在卵巢的颗粒细胞层。高倍镜下可见Bax蛋白阳性反应产物主要表达在颗粒细胞胞浆，经苏木素复染后细胞核呈淡蓝色，核仁清晰。对照组大鼠卵巢颗粒细胞Bax蛋白表达的阳性产物染色较浅；模型组Bax蛋白表达的阳性反应产物最深，模型组与对照组相比P＜0．05有差异；而治疗组与模型组比较Bax蛋白阳性反应产物较浅，经分析其差异有统计学意义P＜0．05（表1，图1A、B、C）。

表1 各组卵巢早衰大鼠Bax、Bcl－2蛋白的表达±s，IOD）Table 1 The Bcl－2and Bax protein expression in POF rat ovary（¯x±s，IOD）

表1 各组卵巢早衰大鼠Bax、Bcl－2蛋白的表达±s，IOD）Table 1 The Bcl－2and Bax protein expression in POF rat ovary（¯x±s，IOD）

＊Compared with control，P＜0．05；▲Compared with Model group，P＜0．05

Groups Bax（IOD） Bcl－2（IOD）Control 0．2090±0．00512 0．2424±0．01270 Model 0．2250±0．00860＊ 0．2278±0．01098＊Treatment 0．2172±0．00787▲ 0．2363±0．00457▲

2．卵巢颗粒细胞Bcl－2蛋白的表达

抑凋亡因子Bcl－2蛋白主要表达于卵巢颗粒细胞浆中，多以棕色、棕黄色为主。从表1可以看出，模型组大鼠卵巢颗粒细胞Bcl－2蛋白表达最低，明显低于对照组，其差异有统计学意义（P＜0．05）。Rb1给药后的治疗组可上调环磷酰胺所致卵巢早衰大鼠卵巢颗粒细胞Bcl－2蛋白的表达，与模型组比较其差异具有统计学意义，P＜0．05（表1，图2A、B、C）。

图1 各组大鼠卵巢Bax蛋白的表达与分布。A对照组：颗粒细胞阳性反应物棕褐色颗粒最浅，表达最少；B模型组：颗粒最深，表达最多；C治疗组：颗粒较浅并接近对照组，SABC法 ×400Fig．1The Bcl－2protein expression in POF rat ovary，The positive control group（A）granulosa cell reactant brown granules most shallow，expressing at least；model group（B）deepest expression up；treatment group（C）shallow and close to the control group，SABC×400

图2 各组大鼠卵巢Bcl－2蛋白的表达与分布。A对照组：颗粒细胞阳性反应物棕褐色颗粒最深，表达最多；B模型组：颗粒最浅，表达最少；C治疗组：颗粒较深，Bcl－2蛋白的表达明显增多，SABC法 ×400Fig．2The Bcl－2protein expression in POF rat ovary，The positive control group（A）granulosa cell reactant brown granules deepest expression up；model group（B）most shallow，expressing at least；deeper treatment group，（C）Bcl－2protein expression was significantly increased，SABC×400

3．Western blot检测卵巢颗粒细胞 Bcl－2和Bax的表达

各组大鼠卵巢颗粒细胞的Western blot结果如图1所示，在相对分子量为21kDa处有一清晰的Bax蛋白和26kDa Bcl－2蛋白条带，以43kDaβ－actin为内参采用IOD半定量法进行统计学分析，结果显示对照组，模型组和治疗组3组间Bax蛋白之间的表达均有差异，差异均有统计学意义（P＜0．05）；Bcl－2蛋白治疗组与模型组相比表达上调，其差异有统计学意义（P＜0．05，表2）

表2 各组大鼠Bcl－2和Bax蛋白与β－actin比较±s，IOD）Table 2 The comparation between Bcl－2and Bax protein expression withβ－actin in rats

表2 各组大鼠Bcl－2和Bax蛋白与β－actin比较±s，IOD）Table 2 The comparation between Bcl－2and Bax protein expression withβ－actin in rats

＊Compared with control，P＜0．05；▲Compared with Model group，P＜0．05

Groups Bax Bcl－2 Control 0．60±0．056 0．54±0．080 Model 1．12±0．073▲ 0．50±0．055▲Treatment 0．99±0．048＊ 0．53±0．086＊

图3 N：对照组；E：模型组D：治疗组Fig．3N：Control group E：Model group D：Treatment group

讨 论

POF是由多种病因及复杂机制引起的多基因疾病［3］。化疗药物会导致卵巢的各种不利影响，包括卵巢早衰及不孕［4］。POF的发生主要原因是卵泡闭锁加速，卵泡闭锁实际上是卵巢颗粒细胞及卵母细胞的凋亡。参与细胞凋亡调控的重要基因有很多种，其中Bcl－2和Bax基因对鼠类卵巢颗粒细胞凋亡起决定性作用［5］。一般认为Bcl－2基因通过抗细胞凋亡在肿瘤的发生中发挥作用。Bcl－2可防止或延迟由多种化疗药物所诱导的细胞凋亡。

颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要机制［6－8］，因此，对颗粒细胞凋亡的研究越来越受到人们的重视。细胞是否发生凋亡与凋亡抑制因子和凋亡活化因子之间的平衡密切相关，其中重要的有凋亡抑制因子Bcl－2和凋亡活化因子Bax等。Bcl－2基因及其表达蛋白可明显延长细胞的存活时间，Bcl－2基因位于18q21上约230kb。该基因有3个外显子和2个启动子，指导Bcl－2蛋白合成。Bcl－2蛋白是一个线粒体外膜蛋白，其C端由19个氨基酸组成的疏水段使Bcl－2蛋白可以铆钉于核膜、粗面内质网和线粒体膜上，可能在核膜的运输，核微孔复合物的形成和核膜的维持等方面其重要作用［9－10］。Bax与 Bcl－2基因具有40%的同源性，位于19号染色体，长约4．5kb有6个外显子，指导Bax蛋白的合成。Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl－2增高，抑制细胞凋亡，Bcl－2与Bax的相互作用是其中心环节。Bax不仅能和Bcl－2形成异源二聚体（Bcl－2／Bax）抑制凋亡，而且其自身还能形成同源二聚体（Bax／Bax）诱导凋亡，Bcl－2／Bax和Bax／Bax比率的改变是细胞凋亡的决定因素［11－12］。

本实验结果表明，模型组卵巢颗粒细胞Bcl－2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，Bcl－2／Bax比值明显减小，给予人参皂甙Rb1后卵巢颗粒细胞Bcl－2／Bax比值明显升高，说明Rb1可调控凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax的表达而抑制颗粒细胞凋亡，而对化疗后卵巢早衰大鼠的卵巢起到一定的保护作用，本研究结果将为卵巢早衰患者的临床治疗提供新的治疗思路。

［1］Meskhi A，Seif M W．Premature ovarian failure．Curr Opin Obstet Gynecol，2006，18 （4）：418－426

［2］Cohen LE．Cancer treatment and the ovary：the effects of chemotheraphy and radiation．Ann N Y AcadSc，2008，1 135：123－125

［3］陈蔚，雷小敏．卵巢早衰病因学研究进展．生殖与避孕，2004，24（1）：43－47

［4］Zhao XJ，Huang YH，Yu YC，et al．GnRH antagonist cetrorelix inhibits mitochondria－dependent apoptosis triggered by chemotherapy in granulosa cells of rats．Gynecol Oncol，2010，118（1）：69－75

［5］李洁，杨菁．卵巢早衰动物模型建立的研究进展．生殖与避孕，2006，26（9）：550－553

［6］Dokras A，Habana A，Graldo J，et al．Secretion of inhibin during ovarain stimulation is decreased in infertile women with endometriosis．Fertil Steril，2000，74（1）：35－40

［7］Shiota M，Sugai N，Tamura M，et al．Correlation of mitogen－activated protein kinase activities with cell survival and apoptosis in porcine granulosa cell．Zool Sci，2003，20（2）：193－201

［8］李莉，张三元．绝经过渡期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡趋势与INH－α亚单位表达的研究．中国药物与临床，2006，6（2）：116－118

［9］Reed JC．Bcl－2and the regulation of programmed cell death．J Cell Biol，1994，124（1）：1－6

［10］Murphy KM，Streips UN，Lock RB．Bcl－2inhibits a Fas induced conformational change in the Bas N terminus and Bax mitochondrial translocation．J Biol Chem，2000，275（23）：17225－17228

［11］Tranzi RE，Moir RD，Wagner SL．Clearance of Alzheimer＇s Abeta peptide：the many roads to perdition．Neuron，2004，43（5）：605－608

［12］Allen G，Barnard H，McColl R，et al．Reduced hippocampal functional connectivity in Alzheimer disease．Arch Neurol，2007，64（10）：1482－1487