选择性环氧合酶－2抑制剂联合奥曲肽诱导人胃癌细胞的凋亡

李 楠 冯振中 赵 艳 谷从友 朱 博 葛 霞

（1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽，233030；2南京医科大学动脉粥样硬化研究中心，江苏，210029）

胃癌是常见且治疗困难的消化系统恶性肿瘤，发病率和死亡率高居恶性肿瘤前列［1］。许多患者在确诊时，肿瘤已属晚期或已有转移，对失去手术机会的患者，常规细胞毒性化疗药物效果有限，同时易产生严重的毒副反应，包括骨髓抑制、胃肠道反应、肝损害等。近年来研究发现，非细胞毒性抗肿瘤药物，主要是环氧合酶抑制剂和生长抑素（somatostatin，SST）类似物，可以抑制肿瘤生长，副反应较低。本研究观察联合使用选择性COX－2抑制剂NS－398和生长抑素类似物奥曲肽，对胃癌细胞生长的协同抑制作用，为肿瘤临床治疗提供理论依据。

材料和方法

1．材料

1．1主要试剂

NS－398、奥曲肽及 Caspase－3单克隆抗体均为Sigma公司产品，NS－398粉剂以二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma）溶解，实验所需终浓度100μmol／L，奥曲肽临用时用RPMI－1640培养液稀释到实验所需终浓度1μmol／L；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物公司；RPMI 1640培养基购自GIBCO公司；Annexin V－FITC／碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒为Biouniquer公司产品；COX－2和GAPDH引物合成自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂（Trizol法）购自日本TaKaRa公司；RNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1．2细胞株

人胃癌细胞株BGC－823，购自中国科学院上海细胞生物学研究所，由本教研室传代保存。

1．3主要仪器

CO2培养箱（Harris HW0301．T－VBA型，美国产），流式细胞计数仪（美国Becton Dickinson公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司产品），GDS－8000型凝胶扫描成像系统（美国UVP公司），GeneQuant核酸定量仪（美国Pharmacia Biotech公司），7500Fast Real－Time PCR System（美国 Applied Biosystems公司），超净工作台为苏州净化设备厂产品。

2．方法

2．1细胞培养

将BGC－823细胞用RPMI－1640培养液加10%FBS，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，每日换液一次，2－3d传代一次。实验时取对数生长期细胞，于培养瓶内生长至80%时，用胰酶消化后制成细胞悬液备用。

2．2细胞形态学观察

青辰处于天葬场的外围，骷髅鬼阵的余威便已令他胆战心惊。他蜷缩在大树的背后，在呼嚎的黑风与漫天的沙尘中，努力睁眼朝着阵的中心望。那里，天葬刀朝外散发着血色的光芒，将师父干枯的身子笼罩在其中。那团红芒是一个巨大的骷髅头，与天葬刀刀柄处的骷髅彼此呼应。他对天葬刀非常熟悉，他有一种感觉，那个红色的虚影，就是天葬刀的刀魂。就像人有血肉和灵魂，一把刀，也有躯体和刀魂。它用千年来的无数生命和鲜血滋养，让自己的刀魂生出了灵性。

将收集的胃癌BGC－823细胞稀释为单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104／ml，加入24孔培养板中，每孔2ml，共8孔，待细胞贴壁后，加入三组药物，不加药的2孔为对照组，培养72h。在24h、48h、72h这3个时间点上分别用倒置相差显微镜观察细胞形态，用WinfaStPVR软件记录结果并直接摄片。

2．3细胞生存曲线

取对数生长期细胞1．0×105于50ml培养瓶内，分4组，每组复设3瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养24h。更换培养基，分别加入三组药物，不加药的为对照组，继续培养，分别于1－5d各计数一次加药组及对照组的细胞数，取细胞计数平均值，以作用时间为横坐标，细胞计数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2．4流式细胞仪检测细胞凋亡率（Annexin VPI双染色法）

取对数生长期细胞，以1．0×105／ml的细胞浓度接种于24孔板，每孔2ml，经NS－398、奥曲肽和联合应用组处理后继续培养24h，每组设2个复孔，设不加药为对照组。细胞用0．25%胰蛋白酶消化，吹起后收集，在PBS中离心、清洗2次，用预冷的结合缓冲液重悬细胞，AnnexinV－FITC和PI双染色法，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2．5实时定量（Real－time）PCR测定 COX－2基因表达

取对数生长期细胞，经NS－398、奥曲肽和联合应用组处理后继续培养24h，Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA，测定cDNA浓度。实时定量PCR反应体系测定COX－2mRNA的表达，结果以GAPDH为内参计算相对值。

COX－2：Forward－TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATT；

Reverse－AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT ；

GAPDH：Forward－CCATTTGCAGTGGCAAAG；

Reverse－CACCCCATTTGATGTTAGTG。

2．6Western blot检测 Caspase－3蛋白表达

用裂解液处理收集细胞，BCA法测定蛋白浓度，取80μg胞浆蛋白与6×SDS Loading Buffer混合，95℃加热样品5min。以蛋白提取液样品作SDS－PAGE电泳后转膜，封闭后加入一抗，抗体稀释浓度为1∶1000，于4℃摇动下过夜，次日用TBST清洗，10min×3次。将膜与辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2h，抗体稀释浓度为1∶3000，TBS－T清洗10min×3次。临用前将ECL显色液A与B 1∶1混和，均匀滴加至膜表面，用高敏荧光成像系统观察结果。

3．统计学处理

实验结果以均数±标准差（¯x±s）表示，所得数据用SPSS14．0统计软件包 One－Way Anova检验进行统计学处理，显著性检验采用单因素方差分析，P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

1．药物对BGC－823细胞形态的影响

药物作用后，在24h、48h、72h这3个时点上分别用倒置相差显微镜观察细胞形态，对照组细胞生长旺盛，贴壁生长，呈单层鹅卵石样紧密排列，为不规则多边形，胞质均匀透明，核质比较大，伪足较长（图1A）；实验组：给予NS－398，细胞生长明显受抑制，大部分细胞伪足回缩，排列杂乱，折光率下降（图1B）；给予奥曲肽，细胞变小变圆，或松散或聚集成团（图1C）；联合用药大部分细胞固缩、分解，出现细胞碎片和悬浮现象，细胞形态改变明显强于单独用药组（图1D），且存在时间依赖性（图2），即两种药物单独使用或联合使用48h的细胞形态学改变明显强于24h（P＜0．05），两种药物单独使用或联合使用72h的细胞形态学改变明显强于48h（P＜0．05）。

A Control 24h（×100）；B 100μmol／L NS－398 24h（×100）；C 1μmol／L Octreotide 24h（×100）；D 100μmol／L NS－398＋1μmol／L Octreotide 24h（×100）图1 四组药物作用24h细胞形态学变化Fig．1Changes in the morphology of BGC－823cells dealed with four－group drugs for 24h

图2 药物作用的时间依赖性Fig．2Time depengence of drug action（＊P＜0．05vs．24h，＃P＜0．05vs．48h）

2．药物对BGC－823细胞生长的影响

处于对数生长期的人胃癌细胞株BGC－823在未给予药物干预时细胞分裂增殖旺盛；单独给予100μmol／L NS－398，1μmol／L奥曲肽时，细胞分裂增殖在干预后第3d开始出现明显减缓，第5d甚至出现“负增长”；联合100μmol／L NS－398＋1μmol／L奥曲肽时，细胞分裂增殖在干预后第2d开始出现明显减缓，第3d出现“负增长”。结果表明药物不仅抑制细胞的增殖，而且导致细胞死亡，联合组抑制细胞增殖、促进细胞死亡的作用明显强于单独用药组（图3，图4）。

＊P＜0．05Control vs．NS－398and Octreotide图3 药物对BGC－823细胞生长曲线的影响Fig．3Drugs influence the growth curve of BGC－823cells

＊P＜0．05Control vs．NS－398and Octreotide＃P＜0．05Combined vs．NS－398and Octreotide图4 药物对BGC－823细胞生长的影响Fig．4Drugs influence the growth of BGC－823cells

3．药物诱导BGC－823细胞凋亡

在流式细胞仪的散点图上，1区为坏死细胞群，2区为晚期凋亡细胞群，3区为存活细胞群，4区为早期凋亡细胞群（图5）。FCM检测显示随着作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加。作用24h时，单纯NS－398组、单纯奥曲肽组、联合组与对照组相比较，差异具有显著性（P＜0．01），联合组细胞凋亡率显著高于单一用药组（P＜0．01）；48h时，单纯 NS－398组、单纯奥曲肽组、联合组与对照组相比较，差异具有显著性（P＜0．01），联合组细胞凋亡率显著高于单一用药组（P＜0．01），与24h组相比较，凋亡率差异具有显著性（P＜0．01）（表1）。

表1 流式细胞仪测定药物诱导BGC－823细胞的凋亡率Table 1 Effect of drugs on apoptosis of BGC－823cells by flow cytometry（FCM）

图5 药物作用48h对BGC－823细胞凋亡率的影响Fig．5Effect of drugs on apoptosis of BGC－823cells for 48h

4．药物处理后BGC－823细胞 COX－2mRNA表达的变化

空白对照组的BGC－823细胞COX－2表达水平较高，分别经三组药物作用24h后，与对照组相比表达均下调（P＜0．05），联合用药组COX－2mRNA表达显著低于单一用药组（P＜0．01）（表2）。

表2 BGC－823细胞COX－2mRNA表达的比值（%）Table 2 The ratio of COX－2mRNA in BGC－823cells（%）

Values are expressed as mean±SD．＊P＜0．05vs．control，＃P＜0．01vs．NS－398，△P＜0．01vs．Octreotide

5．药物处理后 BGC－823细胞 Caspase－3蛋白的表达

NS－398、奥曲肽及联合应用组处理BGC－823细胞24h后，Caspase－3蛋白表达率分别为26．14%、33%、67．34%，均较对照组升高（P＜0．05），并且联合应用组表达量明显高于单一用药组 （P＜0．05）（图6）。

图6 药物对BGC－823细胞Caspase－3蛋白表达的影响Fig．6Effect of drugs on the expressions of Caspase－3protein

讨 论

环氧合酶－2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，在胃癌、大肠癌、食管癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中高表达，并与肿瘤复发、血行转移和预后密切相关［1］，提示以COX－2作为肿瘤治疗的分子靶向，使用COX－2抑制剂防治肿瘤，可能成为肿瘤治疗的新方向。本实验结果表明，选择性COX－2抑制剂NS－398可以显著抑制人胃癌BGC－823细胞的增殖，在一定范围内，具有明确的时间依赖性，而倒置相差显微镜观察和流式细胞仪检测均表明NS－398也具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。奥曲肽是人工合成的SST类似物，SST及类似物与其特异性受体结合后，可降低丝裂原活化蛋白激酶活性，干扰细胞周期，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡［2］；也可降低肿瘤的血管内皮生长因子水平，减少肿瘤血管形成，抑制肿瘤侵袭和转移［3］。本实验结果提示奥曲肽能直接诱导胃癌细胞凋亡，这是其抗肿瘤作用的重要机制之一。

NS－398和奥曲肽对胃癌BGC－823细胞的增殖均有抑制作用，但两种药物联合治疗对肿瘤的抑制作用及相关机理研究较少。本实验结果显示联合用药对BGC－823细胞的生长呈协同抑制作用，其效果明显高于单一用药组。由于NS－398和奥曲肽抗肿瘤的机制不尽相同，具体在哪些共同环节上产生协同作用尚不清楚，可能的机制包括：①上调Caspase－3蛋白表达：Caspase－3是凋亡的执行者，在细胞凋亡的信号传导中处于最下游，许多凋亡的信号最终会集结到此蛋白［4］。Caspase－3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase－3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。在本实验中，NS－398和奥曲肽作用均使BGC－823细胞中Caspase－3蛋白表达上调，联合用药后，Caspase－3蛋白表达增加更为明显，提示NS－398和奥曲肽均能直接诱导胃癌细胞凋亡，这是其协同抗肿瘤的重要机制之一［5］。②环氧合酶途径：恶性肿瘤中COX－2一般呈高表达，COX－2通过促进前列腺素E2（PGE2）的合成，刺激肿瘤新生血管形成，肿瘤新生血管是肿瘤生长和转移的基础，它可以为肿瘤生长提供充足的血供，同时不断地向宿主输出肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的生长和侵袭。本研究发现，NS－398和奥曲肽可有效降低BGC－823肿瘤细胞中 COX－2的含量［6］，抑制胃癌的血管生成，从而抑制癌细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，而联合应用时COX－2的表达降低更明显，抑制增殖更有效，提示两者可通过抑制COX－2的表达产生协同抗肿瘤作用。有研究报道，奥曲肽能抑制转录激活蛋白－1（AP－1）的活化，而 COX－2启动子上有 AP－1结合位点［7］，当两者联合应用时，可能加强抑制 AP－1的DNA结合活性，降低COX－2及其他生长因子的水平甚至停止，从而产生显著的抑制肿瘤生长、诱导肿瘤死亡的作用［8］。③信号通路途径：MAPK信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中有着重要的作用，可以促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤血管生成等。奥曲肽可通过SSTR的介导激活酪氨酸磷酸化酶（PTP），从而调控 MAPK活性，影响癌基因c－myc、c－jun的转录，抑制 DNA 的合成，使肿瘤细胞进入 G0期而停止增殖［9］；Hussin等［10］的研究发现NSAIDs也能抑制 MAPK通路中细胞外信号调节激酶ERK，两者联合应用可能共同抑制了MAPK信号通路的活化，减少肿瘤DNA、蛋白质的合成，抑制肿瘤生长。

综上所述，选择性COX－2抑制剂能够抑制肿瘤生长，同时可避免胃肠道黏膜损伤等不良反应，奥曲肽也具有抗肿瘤的作用，并与生长抑素受体结合抑制胃酸分泌，进一步减少胃肠道黏膜损伤，所以奥曲肽联合NS－398对肿瘤治疗有高效、协同抑制、低副作用等优点，具有良好的临床应用价值。本实验结果来自于体外培养的胃癌BGC－823细胞株，对于药物在体内的效果及机制尚不明确，还需建立动物模型甚至临床研究予以证实。

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