褪黑素对小鼠MFC前胃癌细胞ERK、Akt及NF－κB表达的影响

徐 丽 宫 喜 刘 卉 宋 军 周瑞祥＊

（1福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系 神经生物学研究中心 福州350004；2莆田学院基础医学院生理学教研室 莆田351100）

胃癌是人类最常见恶性肿瘤之一［1］，我国是胃癌高发区之一，近年来不少地区胃癌发病率呈上升趋势，探讨其发生发展机制以及寻找有效的治疗手段是目前研究的重点。褪黑素化学名称为N－乙酰基－5－甲氧基色胺，主要由机体的松果腺合成分泌。研究发现［1］褪黑素对肿瘤患者和动物的实验性肿瘤生长均有抑制作用。本课题组前期实验已证实褪黑素在体内体外均明显抑制小鼠MFC前胃癌细胞增殖［4，5］，但具体作用机制仍未明了。

ERK1／2是细胞内调节增殖的关键信号通路之一，参与肿瘤的发生、发展、转移［6］，磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）－Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡［7］，NF－κB是一种真核细胞的转录因子，是胃癌发生发展的关键环节之一［8］。本部分运用 CCK－8、Western blot等技术手段探讨褪黑素在抑制小鼠MFC前胃癌细胞增殖过程中对ERK、Akt及NF－κB表达的影响。

材料和方法

1．小鼠MFC前胃癌细胞株的培养

小鼠MFC前胃癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院，将处于对数生长期的MFC细胞传代后制成单细胞悬液，以每孔5×105浓度接种于六孔细胞培养板中，于37℃、5%CO2常规培养，待细胞贴壁后用2mmol／L褪黑素（Sigma公司，MW 232．2）干预，培养0min，30min，1h，6h，24h，48h，72h。

2．免疫印迹法检测褪黑素对 MFC细胞p－ERK／ERK、p－Akt／Akt及 NF－κB蛋白表达的影响

从培养箱中取出细胞，加入0．5ml细胞裂解液（每100μl RIPA中加入1μl PMSF），提取的总蛋白样品经BCA法测定蛋白浓度，配置12%SDSPAGE分离胶及5%浓缩胶，取30μg蛋白质上样，110V恒压电泳1．5h，110V恒压，冰上转膜2h。室温中封闭1h后分别与待测蛋白的第一抗体反应，所用的第一抗体稀释度分别为：兔抗p－ERK、兔抗ERK、兔抗p－Akt、兔抗 Akt及 NF－κB多克隆抗体（均为Cell Signaling公司）均为1∶1000，兔抗Actin抗体（Santa Cruz公司）为1∶2000。抗体与膜上的抗原4℃反应过夜后，运用BeyoECL Plus工作液显色，凝胶成像分析。

3．PI3K抑制剂 Wortmannin对MFC细胞增殖活性的影响

细胞以5000个／孔的密度接种于96孔板，取phosphatidylinositol 3－kinase（PI3K）抑制剂 Wortmannin（碧云天生物公司），用DMSO（上海生工生物工程公司）配制浓度为20mg／ml，随后用培养基稀释至1μmol／L，细胞贴壁后给予1μmol／L Wortmannin和／或2mmol／L褪黑素。用药8h后，加入含10μl CCK－8（日本同仁化学研究所）溶液的培养液100μl，37℃细胞培养箱内继续孵育1h；450nm测定吸光度。实验分为四组：空白对照、MLT组、Wortmannin组、Wortmannin＋MLT组，每组设复孔，实验重复三次。

4．统计学处理

采用SPSS16．0统计软件，所有数据行单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析，以P＜0．05为有显著性差异。

结 果

1．褪黑素对MFC细胞p－ERK／ERK表达的影响

ERK1／2是调节细胞增殖的关键信号通路之一，我们应用Western blot技术分析该途径是否参与介导褪黑素抑制MFC细胞增殖过程。结果如图1显示：给予2mmol／L褪黑素干预30min时，p－ERK表达下降，但没有统计学意义，当干预时间达24h时，p－ERK表达明显下降，48h仍处于较低水平，每组ERK表达均未见明显改变，因此p－ERK／ERK比值在24h、48h下降，差别有统计学意义（P＜0．05）。

图1 褪黑素对MFC细胞p－ERK／ERK表达的影响（“＊”示与空白对照组比较，P＜0．05）Fig．1Effect of melatonin on p－ERK／ERK expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

2．褪黑素对MFC细胞p－Akt／Akt表达的影响

PI3K－Akt信号通路广泛参与细胞增殖、凋亡等调控，为证实该途径是否参与介导褪黑素抑制MFC细胞增殖过程，我们应用Western blot技术分析相关蛋白活性变化。结果如图2显示：给予2mmol／L褪黑素干预24h时，p－Akt表达明显下降，48h仍处于较低水平，Akt表达均未见明显改变，因此p－Akt／Akt比值在24h、48h下降，差别有统计学意义（P＜0．05）。

图2 褪黑素对 MFC细胞p－Akt／Akt表达的影响（“＊”示与空白对照组比较，P＜0．05）Fig．2Effect of melatonin on p－Akt／Akt expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

3．PI3K抑制剂Wortmannin对MFC细胞增殖活性的影响

为进一步了解PI3K－Akt信号途径在褪黑素抑制MFC细胞增殖信号通路中的意义，我们检测PI3K抑制剂Wortmannin对MFC细胞增殖的影响。Wortmannin可以通透细胞，和PI3K的110kD催化亚基相结合，特异性抑制PI3K，从而抑制PI3K－Akt信号途径，包括抑制Akt磷酸化等。结果显示，Wortmannin或MLT干预8h后，均可明显抑制MFC细胞增殖活性，而且 Wortmannin与MLT作用有明显协同效应。

图3 PI3K抑制剂Wortmannin与褪黑素对MFC细胞增殖活性的影响（“＊”示与空白对照组比较，P＜0．05，“＊＊”示P＜0．01）Fig．3Effect of Wortmannin，a antagonist of PI3K，and MLT on MFC cell proliferation activity（＊P＜0．05vs blank control，＊＊P＜0．01vs blank control）

4．褪黑素对MFC细胞NF－κB表达的影响

NF－κB是胃癌发生发展中的关键环节之一，为了解其在褪黑素抑制MFC细胞增殖中的意义，我们检测了NF－κB的蛋白表达，结果显示，2mmol／L褪黑素干预30min，1h，6h，24h，48h，72h，NF－κB的表达均未见明显改变（P＞0．05）。

图4 褪黑素对 MFC细胞NF－κB表达的影响（“＊”示与空白对照组比较，P＜0．05）Fig．4Effect of melatonin on NF－κB expression in MFC cells（＊P＜0．05vs blank control）

讨 论

胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。哺乳动物细胞内，蛋白激酶家族－丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）是最重要的信号转导途径之一，对细胞的癌变及肿瘤的发生发展起到重要的调控作用。MAPKs是一个蛋白激酶家族，目前已发现MAPKs家族中最重要的是ERK1／2，ERK1／2是细胞内调节增殖的关键信号通路之一，可直接影响细胞的增殖能力。细胞内，只有磷酸化的ERKl／2才具有活性，而激活的ERKl／2可通过多条途径促进肿瘤的发生、发展、转移等过程［9］，例如：活化的ERK由胞质转位至细胞核，可通过磷酸化Elk－1三重复合物而诱导c－fos基因，最终激活激动蛋白－1（AP－1），AP－1可增加细胞周期素 Dl（Cyclin D1），促进细胞分裂增殖［10］；磷酸化的ERK能够活化 NF－κB，进一步诱导抗凋亡基因Bcl－2、Bcl－XL的表达，并促进Bcl－2的磷酸化，降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，促进Bad、Bim降解，发挥抗凋亡作用［11］；激活的ERK可通过增强 AP－1活性，促进基质金属蛋白酶（MMPs）mRNA转录和蛋白表达，MMPs可降解细胞外基质蛋白，从而促进肿瘤的发展和侵袭［12］。因为ERK1／ERK2参与肿瘤的发生、发展、转移，因此，ERK1／ERK2通路抑制剂目前在临床上已被用作一种新型抗癌药物。在我们的研究中发现，当褪黑素作用24h、48h时，MFC细胞ERK1／2的磷酸化水平明显低于对照组，而ERK1／2总量不变。说明褪黑素不是通过抑制MFC细胞ERK1／2表达而是通过抑制ERK1／2的激活，从而抑制胃癌细胞MFC增殖。

另一条与肿瘤发生发展密切相关的信号通路是磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）－Akt，PI3K－Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡。PI3K可调节Akt的磷酸化过程，Akt是P13K通路中的关键分子，产生P13K途径的主要生物学效应，主要包括控制细胞增殖及抑制细胞凋亡［13］。相关机制包括：增加抗凋亡基因Bcl－2的表达；直接或间接磷酸化Bcl－2家族中的促凋亡蛋白Bad上Ser136位残基，从而终止Bad在线粒体膜上对Bcl－2或Bcl－XL的拮抗作用，使被释放后的 Bcl－2或Bcl－XL能恢复其抗凋亡功能［14］；活化的Akt也可磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p21Cip1和p27Kip1，p21Cip1被磷酸化后从细胞核中退出，并解除对CDK的抑制，从而引起细胞周期变短，加速细胞周期进程；Akt还可抑制Caspase活化等。临床上多种肿瘤，如胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、前列腺癌、结肠直肠癌等都可见到PI3K－Akt通路的过度激活［15］，而抑制PI3K或Akt的活性，就可起到有效的抗肿瘤治疗作用。本研究中褪黑素在作用24h、48h后明显抑制p－Akt的产生，说明抑制Akt激活也是褪黑素抑制MFC细胞增殖的重要机制之一。应用PI3K抑制剂Wortmannin干预8h后，可明显抑制 MFC细胞增殖活性，而且 Wortmannin与MLT在抑制MFC增殖作用上有明显协同效应，这就进一步说明褪黑素通过抑制p－Akt产生，从而抑制肿瘤细胞增殖。

NF－κB是一种核转录因子，由 RelA、RelB、RelC、NF－ΚB1和 NF－κB2组成。在肿瘤细胞中，NF－κB即有可能抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞生长［16］，也有可能作为促凋亡因子诱导细胞凋亡［17］。在胃癌发生发展过程中，NF－κB可通过调节Bcl－2家族、IL－8、COX－2等［18］，最终促进胃癌 的发生 发展。为进一步探讨褪黑素抑制胃癌细胞增殖机制，我们检测褪黑素对MFC细胞NF－κB表达的影响，结果未发现褪黑素对NF－κB有影响。

综上所述，褪黑素是通过抑制ERK1／2、Akt磷酸化，而不是通过抑制 ERK1／2、Akt及 NF－κB表达，从而发挥其体外抑制胃癌细胞增殖的作用。

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