siRNA 沉默PACE4 基因对乳腺癌MCF-7 细胞生物学行为的作用

王菲菲 王 林 潘继红

乳腺癌发生率自20 世纪70 年代末开始一直呈上升趋势。在我国，近年来由于人们生活方式、生活环境的改变，乳腺癌发生率的增长速度也迅速上升。迄今为止，乳腺癌的病因还未完全清楚，但是发病具有一定的规律性，其中许多研究表明，乳腺癌的发生与某些特定的基因密不可分［1，2］。近年来研究发现，蛋白原转化酶家族与癌症的关系密切，其中furin 和PACE4 尤为重要，二者在肿瘤的增殖、迁移等过程中均发挥着重要的作用［3］。Cheng 等［4］已经证实，与正常组织相比，PACE4 在乳腺癌中呈过表达。因此，本实验借助RNA 干扰技术，以化学合成的siRNA 瞬时转染人的乳腺癌MCF-7 细胞，通过qRT-PCR 以及Western blot 检测基因沉默效率，筛选出特异性的siRNA，采用体外培养的方法观察其对MCF -7 细胞的增殖能力和迁移能力以及细胞周期的影响。

材料与方法

1.试剂与材料:HiPerFect 转染试剂(QIAGEN，德国)，胎牛血清(Hyclone，美国)，DMEM 培养基(Hyclone，美国)，兔抗人多克隆抗体ab39877(Abcom，美国)，RNA 提取试剂盒(OMEGA，美国)，反转录试剂盒(TOYOBO，日本)，实时荧光定量PCR 试剂(Roche，德国)，3 -(4，5 -二甲基噻唑-2)-2 -二苯基四氮唑溴盐、DMSO 均购自索莱宝公司，siRNA 和PACE4引物由上海吉玛设计合成，人乳腺癌MCF -7 细胞株购自中科院上海细胞库。

2.细胞的瞬时转染:细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM 中，正常培养至80%融合时，加入胰酶消化，以3.0 ×105接种于24 孔板，按照HiPerFect 转染试剂的说明书进行瞬时转染，在24h 和36h 收集细胞。细胞分组:①siRNA-1 oligo干扰(1 -siPACE4)组;②siRNA -2 oligo 干扰(2 -siPACE4)组;③NC 组(阴性对照组);④MOCK 组(转染试剂对照组)。

3.实时荧光定量PCR:采用RNA 提取试剂盒提取细胞RNA，按照反转录试剂盒的方法将RNA 反转录成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR 扩增。Human GAPDH 作为内参，进行标准化。反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，反应40 个循环。以CT 法比较表达含量的表达变化。同时，产物进行琼脂糖凝胶电泳，进一步验证定量结果。实验重复3 次。其中PACE4 引物设计:5' - AAGCAAGGGAAGTTGAAAGA-3'(上游引物)，5' - CACTGAAGGTGTGGTACG-3'(下游引物)，GAPDH 引物设计:5' -CACCATCTTCCAGGAGC - 3' (上游引物)，5' - AGTGGACTCCACGACGTA-3'(下游引物)。

4.蛋白水平检测:采用Western blot 方法检测:取转染后细胞提取蛋白，利用Bradford 方法对蛋白定量，采用湿法转膜将蛋白转到PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭洗脱1h，加入兔抗人-PACE4 多克隆抗体，4℃过夜，洗膜后，加入二抗37℃孵育1h，增强型化学发光试剂(ECL)显影、定影。

5.MTT 法检测细胞增殖:细胞以3.0 ×104接种于96 孔板上，瞬时转染，设置对照组，每组设置3 个重复孔，分别在转染后24、36、48h 加入20μl MTT，避光培养4h 后吸出培养基MTT 混合物，加入150μl DMSO，室温摇床放置10min，酶标仪上测定各孔A 值。

6.细胞迁移试验:将处于对数生长期的细胞以8.0 ×104接种于24 孔板，细胞融合达到80%时，采用20μl 枪头在孔中划3 条平行线，用PBS 漂洗2 次去除划下的悬浮细胞，瞬时转染，继续培养36h 后，倒置显微镜下分别观察0h 和36h 时划痕中细胞迁移情况。显微镜下任取5 个视野对进入划痕中的细胞计数。实验重复3 次。

7.流式细胞仪检测细胞周期:将处于对数生长期的细胞以1.0 ×106接种于6 孔板，干扰过程同前。设置干扰组，阴性对照组和转染试剂组。干扰24h 和36h 后按照周期试剂盒测定，使用BD 流式细胞仪，分析软件，重复3 次试验。

8.统计学方法:应用SPSS 17.0 统计分析软件，结果以均数±标准差(±s)表示，多样本间比较采用单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.siRNA 基因沉默对PACE4 基因的影响:(1)mRNA 水平:通过荧光定量PCR 对PACE4 的表达进行检测，与对照组相比，PACE4 基因的2 -siRNA 的mRNA 在36h 抑制效果最明显(图1，P ＜0.01)。将36h 的qRT-PCR 结果进行琼脂糖凝胶，结果如图2，与上述结果一致。(2)蛋白水平:通过Western blot检测转染后PACE4 蛋白在MCF -7 细胞中的表达，结果显示，在36h 时2 -siRNA 蛋白水平与对照组相比表达明显降低，抑制效果最明显，如图3、图4，此结果也与实时荧光定量PCR 结果一致。

图1 siRNA 转染MCF-7 细胞PACE4 mRNA 在24h 及36h 的相对表达水平

图2 琼脂糖凝胶电泳验证siRNA 转染乳腺癌MCF-7 细胞36h 时的PCR 结果

图3 siRNA 转染MCF-7 细胞24h 蛋白表达量

图4 siRNA 转染MCF-7 细胞36h 蛋白表达量

2.MTT 法检测siRNA 对乳腺癌MCF -7 细胞增殖能力的影响:结果表明在转染24、36和48h后，细胞的增殖速度与对照组相比明显降低，且差距具有统计学意义(图5，P ＜0.05)，结果也表明2 -siRNA在36h 的抑制效果最明显。故挑选2 -siRNA 继续进行以下实验。

图5 MTT 方法检测siRNA 沉默PACE4 的表达对乳腺癌MCF-7 细胞增殖的影响

3.PACE4 siRNA 对MCF -7 细胞迁移能力的影响:采用细胞划痕的方法对细胞迁移能力进行检测，结果表明，在转染36h 后，与0h 相比，沉默组细胞进入划痕的细胞数明显少于对照组，任取5 个视野对进入划痕的细胞进行计数比较发现，处理组与对照组间差距具有统计学意义(图6、图7，P ＜0.05)。

4.PACE4 siRNA 对MCF-7 细胞周期的影响:利用流式细胞仪测定沉默PACE4 后对MCF -7 的作用，结果表明在24h 和36h，PACE4 的沉默对细胞周期的影响没有统计学意义，如图8 中A、B 所示。

图6 细胞划痕检测siRNA 沉默PACE4 对乳腺癌MCF-7 细胞迁移能力的影响

讨 论

乳腺癌的发生率已经位居女性恶性肿瘤的首位。随着筛查工作以及综合治疗的开展，乳腺癌已经成为疗效最佳的实体肿瘤之一，但是其病因的不确定性，使得对于乳腺癌的预防和治疗仍需要得到人们的重视。目前对于乳腺癌的治疗主要是放疗、化疗以及手术的方法，但是对于病患造成的伤害也是巨大的。随着基因治疗的不断发展，分子靶向治疗有望对于乳腺癌的治疗提供新的希望。目前，在肿瘤的研究中，RNA 干扰技术已经作为一种高度特异性沉默基因的方法被广泛使用［5，6］。它的使用对肿瘤的基因研究，特别是作为对基因功能和基因治疗等方面，以及体外实验的顺利进行提供了新的途径。

图7 细胞划痕实验36h 进入划痕中的细胞

图8 流式细胞仪测定siRNA 沉默PACE4 对MCF-7 细胞周期的影响

PACE4 是一种Ca2+依赖的枯草杆菌样内切蛋白酶，具有裂解偶合基本氨基酸序列的活性，其主要通过激活多种神经肽类激素、生长因子、金属蛋白酶类、膜结合蛋白及转录因子等来发挥其作用［7～10］。对肿瘤细胞的增殖、转移等起着重要作用。PACE4 在不同类型的肿瘤中表达特点不同，Bassi 等［11］发现PACE4 在皮肤癌中呈现过表达，此后他们还证明了利用PACE4 抑制剂可以明显降低癌细胞的增殖率和迁移率［12］。另外D'Anjou 等［13］发现在蛋白原转化酶家族中，只有PACE4 在前列腺癌中过表达。然而PACE4 在卵巢癌、子宫内膜癌中都呈低表达［14～16］。

近年来随着新的致病基因被不断的发现和提出，人们对于乳腺癌易感基因的研究也进入了一个新阶段［17］。本研究中利用siRNA 技术，合成靶向PACE4基因的siRNA，成功转染MCF -7 细胞。特异性沉默PACE4 的表达，研究其对乳腺癌细胞的增殖、迁移以及细胞周期的影响。结果表明PACE4 基因的沉默，可以有效地降低细胞的增殖和迁移能力，沉默组与对照组相比差距都具有统计学意义(P ＜0.05)。后续笔者在不同的时间采用流式细胞仪对细胞周期进行测定发现，PACE4 的沉默对于细胞周期的影响没有统计学意义，其原因为细胞是一个具有复杂功能的个体，其周期的影响涉及很多因素。

本研究初步表明，PACE4 在乳腺癌的增殖和迁移中起到了重要的作用，下调其表达可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，但其具体的作用机制还需进一步的研究。近来我们实验室利用基因芯片的方法对PACE4 的下游基因进行了一系列的筛查，正在努力找出在乳腺癌中与增殖和迁移相关的下游基因，对PACE4 的作用机制进一步探索。相信PACE4 有望作为乳腺癌基因治疗的一个新的靶点，为新药的开发提供一个新的依据。

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