石决明提取液对晶状体抗氧化能力的影响

崔丽金 徐国兴

白内障是中国乃至全世界的首位致盲眼病，氧化损伤在白内障的发生、发展中起重要作用。石决明性味咸而微寒，入肝、肺、肾三经，为清肝明目、平肝潜阳之药，可用治目赤翳障、青盲雀目、怕光羞明、视物昏花等各种虚实眼科疾患［1］。石决明自古以来即为清肝明目、退翳除障之药，已有石决明的复方制剂用于防治白内障的实验室研究［2，3］。本研究通过体外培养氧化损伤的人晶体上皮细胞探讨其抗氧化损伤的作用。

材料与方法

1.材料:(1)实验细胞:人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECsSRA01/04)(上海复蒙基因生物科技有限公司)。(2)石决明中药水提取液:福建医科大学眼科研究院提供。(3)试剂:DMEM/HIGH GLUCOSE(1 ×)、胎牛血清(美国Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(美国Gibco 公司);3%H2O2(南昌白云药业有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)测试盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒和Bradford 蛋白质定量试剂(自南京建成生物工程研究所);CCK-8、PMSF(100mmol/L)、Western 及IP 细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)。(4)仪器:BIO-RAD 550 型酶标仪(美国)，722G 可见分光光度计，DT5 -3 型台式低速自动平衡离心机(北京)，台式高速冷冻离心机(德国)，AIR -TECH BCM - 1000A 型生物洁净工作台(苏州)，THERMO FORMA 311 型水套式CO2培养箱(美国)，OLYMPUS 1 ×70荧光倒置相差显微镜(日本)，数显恒温水浴锅，SHE-Ⅲ型循环真空泵。

2.方法:(1)实验分组:人晶体上皮细胞(HLECs)加入含10%胎牛血清的DMEM-HG 培养基中，置于37℃、100%湿度和5% CO2的培养箱中培养。细胞生长至接近瓶底约80%时及时冻存或传代，按1∶3 ～1∶4 传代。实验分组:①空白对照组:HLECs + DMEM 维持液;②阳性对照组:HLECs +DMEM维持液+ 0. 15mmol/L H2O2;③石决明实验组:HLECs +DMEM 维持液+0.15mmol/L H2O2+不同浓度的石决明提取液(分别为0.001%、0.01%、0.1%、0.3%)。(2)CCK -8 法检测不同浓度石决明提取物对HLECs 增殖能力的影响:消化并收集生长状态良好、呈对数生长期的HLECs，接种于96 孔培养板中，细胞密度为8 ×104个/毫升，置于37℃、100%湿度和5% CO2的培养箱中培养1 天，弃去培养液，按照上述实验分组，需H2O2干预的组别用H2O2干预3h，同时加不同浓度的石决明与细胞共培养1、3 和5 天后除去旧的培养液，各组培养板分别加入10μl CCK-8 和90μl 培养基的混合液，置于培养箱中继续孵育1h 后于全自动酶标仪上450nm 波长比色测定，测定各组的吸光值，即OD 值。细胞活力(%)=(实验组平均OD 值-空白组平均OD 值)/(正常组平均OD 值-空白组平均OD 值)×100%。(3)检测石决明提取物对HLECs中SOD、GSH、MDA 水平的影响:消化并收集生长状态良好、呈对数生长期的HLECs，接种于6 孔培养板中，细胞培养及实验分组同上。按实验分组加H2O2干预3h，同时加浓度为0.1%的石决明提取液与细胞共培养5 天后除去旧的培养液，各组各自消化4℃低温离心，加入300μl 冷的生理盐水，在冰浴中匀浆3min 左右，按说明书的要求用分光光度计检测匀浆液中SOD 活力、GSH 和MDA 含量。

3.统计学方法:应用SPSS 17.0 统计软件分析，用均数±标准差(±s)表示，单因素方差分析进行样本均数间的多重比较，组间两两比较采用LSD-t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.不同浓度及时间点石决明提取液对HLECs 增殖能力的影响:据不同时间点各实验组HLECs 活力存在变化，且各组间比较差异具有统计学意义(1 天时，F=23922.421，P ＜0.01;3 天时，F=120605.864，P＜0.01;5 天时，F=150939.452，P ＜0.01)。从而得出图1，可见H2O2使细胞的活力降低，石决明提取液对H2O2引起的晶状体上皮细胞氧化损伤具有保护作用，提高其活力，且在一定的时间和浓度范围内具有浓度依赖性。当石决明提取液浓度升高到0.1%，作用时间维持达到3 天时，细胞的活力达到最高。

2.石决明提取液对HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平的影响:应用化学比色法检测空白对照组、阳性对照组和0. 1% 石决明实验组HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平显示，SOD、GSH 在空白对照组中最高，阳性对照组中的活力最低，3 组间的差异具有统计学意义(P ＜0.01)。MDA 在阳性对照组中的含量最高，0.1%石决明实验组次之，空白对照组最低，3 组间差异具有统计学意义(P ＜0.01，表1)。

图1 不同浓度及时间点石决明提取液对HLECs 活力的影响

表1 石决明提取液对氧化损伤的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影响(±s，n=8)

表1 石决明提取液对氧化损伤的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影响(±s，n=8)

组间SOD 活力、GSH 含量、MDA 含量比较，P ＜0.01

组别SOD 活力(U/mg)GSH 含量(mg/g)MDA 含量(nmol/mg)212.14 ±2.09 25.37 ±0.74 10.89 ±0.40阳性对照组 158.05 ±2.12 15.05 ±0.61 18.11 ±0.27石决明实验组空白对照组188.64 ±3.02 21.05 ±0.73 14.16 ±0.39

讨 论

氧自由基损伤是老年性白内障首位危险因素，晶状体内自由基主要是超氧阴离子自由基、羟自由基、H2O2，其中羟自由基损害最严重，但超氧阴离子自由基、羟自由基半衰期短，而H2O2相对较稳定，且可以从一处转移到另一处，在SOD、过渡金属(Fe2+、Cu+)存在下发生歧化。本实验应用H2O2与人晶状体上皮细胞共培养造成体外培养晶状体上皮细胞氧化损伤模型［4，5］。各种理化因素均可通过不同途径导致晶状体自由基产生，如自由基产生过多或清除障碍，均可导致自由基聚积。自由基最先损害的靶目标是晶状体上皮细胞，其次是晶状体纤维。晶状体上皮细胞是抗氧化损伤的活性中心，通过两个途径发挥抗氧化的作用。第1 个途径是以还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、抗坏血酸和维生素E 等抗氧化剂为代表的清除自由基机制［6］。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团，巯基具有还原性，作为体内重要还原剂保护蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。在哺乳动物体内，晶状体是富含GSH 的组织之一。抗氧化酶系是晶状体另一个抗氧化屏障，主要是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和SOD。生理状态下晶状体中氧化和抗氧化二者处于动态平衡，但当机体氧化物质产生过多或清除这些物质的能力下降时，晶状体将受到损伤，表现在GSH、SOD 含量大幅度下降［7］。

实验中从CCK -8 检测各实验分组不同时间点细胞增殖情况的统计数据得出的图1 可见:H2O2使细胞的增殖能力降低，石决明提取液对H2O2引起的晶状体上皮细胞氧化损伤具有保护作用，提高其增殖能力，恢复细胞活力，且在一定的时间和浓度范围内具有浓度依赖性。当石决明提取液浓度升高到0.1%，作用时间维持达到3 天时，细胞的增殖能力最高，活力达最佳。

本实验研究结果显示相对于空白对照组，阳性对照组中晶状体上皮细胞内的SOD 活力和GSH 含量降低，提示其抗氧化系统活力减弱，说明H2O2对晶状体上皮细胞具有氧化损伤作用，石决明组使晶状体上皮细胞中降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，说明石决明对氧化损伤的晶状体上皮细胞中抗氧化系统有保护作用，这与石决明对白内障大鼠晶体中SOD、GSH 及GSH -PX 的影响结果相一致［8］。相较于空白对照组，阳性对照组中晶状体上皮细胞中MDA 明显增多，提示H2O2使晶体上皮细胞受到氧化损伤，使晶体细胞内脂质过氧化产物堆积，石决明组中氧化损伤的晶体细胞内MDA 增多有所减轻，降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，说明石决明可能是通过保护晶状体细胞内的抗氧化系统，促进上皮细胞清除自由基，从而减轻细胞的氧化损伤，使MDA 增多有减少，减轻脂质过氧化产物对细胞膜及蛋白质等的攻击，使晶状体上皮细胞避免氧化损伤，从而可能具有潜在的抗氧化作用。据相关的石决明炮制工艺的研究提示，石决明提取液的主要成分为多种离子，包括Ca、Fe、Zn、Cu、Mn 等［9］。有研究表明Fe、Mn、Zn 等离子在不同时间点对蚯蚓体内外的抗氧化酶有不同程度的激活或抑制作用［10］。石决明提取液可能是通过其内的离子对酶的活性产生激活，从而进一步在一定程度上保护细胞免受氧化损伤，提高其活力。

1 温暖荣.石决明散在眼科应用举隅［J］.中西医结合眼科志，1997，15(1):59

2 徐国兴，林媛，王婷婷，等.石决明药理研究及眼科应用进展［J］.国际眼科杂志，2009，9(12):2389 -2390

3 刘静霞，张晓冬，吕瑞民，等. 决明退障丸对亚硒酸钠性白内障大鼠脂质过氧化的影响［J］. 中国中医药科技，2005，12(3):143 -145

4 Gajjar D，Patel D，Alapure B，et al. Rapid action of oestradiol against hydrogen peroxide induced oxidative stress in cataractous lens epithelium:an in vitro study［J］. Eye(Lond)，2009，23(6):1456 -1463

5 Löfgren S，Fernando MR，Xing KY，et al.Effect of thioltransferase (glutaredoxin)deletion on cellular sensitivity to oxidative stress and cell proliferation in lens epithelial cells of thioltransferase knockout mouse［J］. Invest Opthalmol Vis Sci，2008，49(10):4497 -4505

6 Reddan JR，Giblin FJ，Kadry R，et al. Protection from oxidative insult in glutathione depleted lens epithelial cells［J］. Exp Eye Res，1999，(68):117 -127

7 张伟，陈翠真.牛磺酸对亚硒酸钠性白内障抑制作用的实验研究［J］.中华眼科杂志，1998，34:208 -210

8 祁磊，林媛，徐国兴，等. 石决明对大鼠白内障晶状体中SOD 和GSH 及GSH-PX 的影响［J］.国际眼科杂志，2011，12(11):2085-2087

9 王文凯，彭小平.石决明炮制研究［J］.中成药，2004，26(5):377 -379

10 Naqai N，Ito Y，Takeuchi N. Correlation between hyper -sensitivity to hydro- gen peroxide and low defense against Ca2+influx in cataractogenic lens of ihara cataract rats［J］. Biol Pharm Bull，2011，34(7):1005 -1010