VC清除酱油亚硝酸盐的响应面优化

加列西·马那甫，德娜·吐热汗，李俊芳

（1.新疆农业大学化学工程学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学数理学院，乌鲁木齐 830052）

VC清除酱油亚硝酸盐的响应面优化

加列西·马那甫1，德娜·吐热汗2，李俊芳1

（1.新疆农业大学化学工程学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学数理学院，乌鲁木齐 830052）

以酱油为原料，在单因素试验基础上，选取VC浓度、反应温度、pH为自变量，以亚硝酸盐清除率为响应值，采用3因素3水平试验设计法，得到二次多项式回归方程预测模型，优化酱油中亚硝酸盐的清除条件。回归预测模型具有高度显著性，方程对试验拟合较好，可对酱油亚硝酸盐清除率进行分析和预测；响应面图表明，交互项对清除率影响不显著，与回归模型交互项P值的分析结果一致。VC清除酱油亚硝酸盐的最佳条件为VC浓度0.48 μg·mL-1、反应温度46.08℃、pH 2.38。在最佳条件下,酱油亚硝酸盐清除率可达52.4%，实测值为53.7%，两者较接近，拟合性良好，表明Box-Benhnken中心组合试验设计原理结合响应面法，优化酱油亚硝酸盐清除降解条件可行。

酱油；亚硝酸盐；VC；清除；响应面分析法

酱油是传统调味品，原料主要来自大豆和小麦，经微生物酶转化酿造而成[1]。近年来广泛使用的含氮农药、化学氮肥及含氮工业废水、废渣对环境土壤和水造成污染，导致酱油硝酸盐含量增加，在酿造过程中硝酸盐易被还原为致癌物质强氧化物亚硝酸盐，增加亚硝酸盐含量[2]。亚硝酸盐作为发色剂在食品中允许限量使用，因此对食品中亚硝酸盐控制涉及食品安全领域[3]。VC作为抗氧化剂具有较好自由基抑制、抗老化功能和清除亚硝酸盐作用。在食品制作过程中加入少量VC可降低亚硝酸盐含量，可有效阻断亚硝酸盐与仲胺类物质作用合成亚硝胺[4]。VC与亚硝酸盐物质的量比为2∶1时，清除率可达100%[5]。本试验加入亚硝酸钠与VC质量比为5∶1时，亚硝酸盐含量约降低5%，虽是按照反应比例加入，试验样品可能含其他氧化性物质与VC反应，同时氮在氧化还原反应中价态随反应物浓度、条件、物质的量而变化，按反应式很难显现出VC对酱油亚硝酸盐最佳清除效果，表明进一步研究优化试验条件的重要性[6]。本文在单因素试验基础上，采用响应面法[7]研究VC浓度、反应温度、pH对酱油亚硝酸盐清除率影响[8]，建立最佳清除条件与清除率间的数学模型，确定酱油亚硝酸盐最佳清除条件，在该条件下取得酱油亚硝酸盐最佳清除率，为开发有效实用亚硝酸盐天然清除剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆地产酿造酱油（购于乌鲁木齐市某超市，生产日期：20130608，氨基酸态氮不低于0.4 g·100 mL-1）；亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、VC、盐酸，以上化学试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取酱油样品10 g，置于500 mL烧杯中，加25 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，加水150 mL，于沸水浴加热15 min，冷却至室温，加入10%亚铁氰化钾溶液10 mL，摇匀，再加入22%乙酸锌溶液10 mL，沉淀蛋白质；加水至刻度，摇匀，放置30 min，除去上层脂肪，过滤弃去清液初滤液30 mL。滤液备用于酱油中亚硝酸盐的测定试验。

1.2.2 标准工作曲线的绘制

根据GB/T5009.33-2010要求建立亚硝酸盐标准曲线，其回归方程为y=0.00073x+0.00327，R2= 0.9984。

1.2.3 样品中亚硝酸盐的测定

参见文献[7]对酱油中亚硝酸盐含量进行测定。

1.2.4 清除亚硝酸盐试验

精取5 mL样品滤液，置于25 mL比色管中，加1 μg·mL-1VC溶液9.6 mL，加水定容至20 mL，摇匀，水浴40℃，调pH 2.0，反应1 h；加0.2%对氨基苯磺酸溶液2 mL，摇匀，静置5 min，加入0.02%盐酸萘乙二胺溶液1 mL，加水至20 mL，混匀，静置15 min，在538 nm波长处测定吸光度值。按下式计算清除率。

式中，A0-未加样品溶液时NaNO2吸光度值；A-加入样品溶液后NaNO2吸光度值。

1.2.5 单因素试验

分别考查VC浓度（μg·mL-1）、反应温度（℃）和pH 3个因素对酱油亚硝酸盐清除率影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 VC浓度对亚硝酸盐清除率的影响

吸取5 mL已处理好的样品滤液，反应温度和pH不变，VC浓度分别为0.12、0.24、0.36、0.48、0.60和0.72 μg·mL-1时，考查VC对酱油亚硝酸盐清除率影响。当VC浓度为0.48 μg·mL-1时，对亚硝酸盐清除率最高，可达52.4%，因此选择VC浓度为0.48 μg·mL-1，如图1所示。

图1 VC浓度对酱油亚硝酸盐清除率的影响Fig.1 Effects of concentration of VC on the soy sauce nitrite clearance rate

由图1可知，随VC浓度增加，VC对酱油中亚硝酸盐清除率呈规律性变化。开始时随VC浓度增加而快速上升，当加入VC浓度达0.48 μg·mL-1时，VC清除率达52.4%，表明VC能有效清除酱油中亚硝酸盐。这是因为VC酸性来自烯二醇的羟基，由于羟基和羰基相邻，烯二醇基极不稳定，可与各种金属反应成盐，解离出H+，而H+能与NO2-反应，消耗NO2-，从而降低亚硝酸盐含量。

2.1.2 反应温度对亚硝酸盐清除率的影响

吸取5 mL已处理好的样品滤液，VC浓度和pH不变，反应温度分别为20，30，40，50，60和70℃时。当温度为40℃时，VC对亚硝酸盐清除率最高，可达45.0%，因此选择反应温度为40℃，如图2所示。

由图2可知，随反应温度提高，VC对酱油中亚硝酸盐清除率呈规律性变化，起初随VC浓度增加而快速上升，当反应温度达40℃时，VC清除率达52.4%，之后随着反应温度的升高其清除能力下降，表明反应温度对VC清除酱油中的亚硝酸盐有较大影响。因为温度在40℃时，VC和亚硝酸根的反应活化能最高，反应程度最高，对亚硝酸根的清除率也最高。

2.1.3 pH对亚硝酸盐清除率的影响

吸取5 mL已处理好的样品滤液，VC浓度和反应温度不变，pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0时。当pH 2.0时，VC对亚硝酸盐清除率最高，可达47.1%，因此选择pH 2.0，如图3所示。

图2 反应温度对酱油亚硝酸盐清除率的影响Fig.2 Effects of reaction temperature on the soy sauce nitrite clearance rate

图3 pH对酱油亚硝酸盐清除率的影响Fig.3 Effects of pH on the soy sauce nitrite clearance rate

由图3可知，酸性条件下VC表现出较高清除能力，在pH 2.0时，VC对酱油中亚硝酸根清除能力为47.1%，而在pH 6.0时，其清除能力仅为8%。因为VC含有特殊烯醇式结构，随pH升高VC很容易脱氢变成脱氢VC，脱氢VC在水溶液中其C1和C4位置上形成的内酯环被打开，转变成2，3-二酮古龙酸后完全失去活性。

2.2 酱油亚硝酸盐清除条件的参数优化

2.2.1 响应面试验结果

在前面单因素试验结果基础上，以VC浓度（A）、反应温度（B）和pH（C）3个因素为自变量，亚硝酸盐清除率（Y）为响应值，设计3因素3水平试验。试验设计和结果见表1、2。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factor and levels in Box-Behnken design

2.2.2 模型建立与方差分析

根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用SAS 9.1.3软件，对表2中试验数据进行多元回归拟合，可得VC浓度、反应温度和pH与酱油亚硝酸盐清除率的二次多元回归方程为：

式中，A、B、C在设计中均经过量纲线性编码处理，各项系数的绝对值大小直接体现出各因素对响应值的影响程度大小，系数的正负反映影响方向。

对表2中试验结果进行统计分析，得到的方差分析结果如表3所示。

由表3可知，回归方程中各变量对响应值影响显著性，由F检验来判定，概率P值越小，则相应变量的显著程度越高。由方差分析表可知，方程模型F值为93.21%，P＜0.05，表明回归模型显著：失拟项F值为6.52，P值为0.1358＞0.05，表明失拟项相对于绝对误差不显著，说明该回归方程对试验拟合情况较好。各因素中一次项C极显著，B显著，A不显著；二次项中B极显著，A显著，C不显著；交互项不显著，由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

为观察某两个因素及其交互作用同时对提取率的影响，将其他因素条件保持不变，获得某两个因素及其交互作用对提取率影响的一元二次方程，响应面及其等高线图图4，确定因素最佳水平范围。

图4 各因素交互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour line curves of various factors

响应曲面坡度的平缓与陡峭程度，表明在处理条件发生变异时酱油亚硝酸盐清除率的响应灵敏程度，如果响应曲面坡度相对平缓，表明响应值（清除率）对处理条件不敏感；反之，响应值敏感。等高线的形状如果为椭圆形，表示两因素交互作用显著。由图4可知，酱油亚硝酸盐的清除中VC浓度与反应温度、VC浓度与pH、pH与反应温度交互作用不显著，与表3中交互项P值的分析结果一致。

3 结论

在单因素试验基础上，通过响应面Box-Benhnken试验设计原理，建立VC对酱油亚硝酸盐清除率的二次多项式数学模型。优化VC清除亚硝酸盐的最佳条件：VC浓度0.48 μg·mL-1，反应温度46.08℃，pH 2.38。在此条件下实际测定清除率可达52.4%，与模型预测值53.7%基本相符。且此方法具有安全无毒、成本低、清除率高、操作简单等特点，可为进一步研究VC在抗氧化食品、药品、化妆品中的应用以及药理学研究提供理论依据。

[1]徐伟丽,单毓娟,张兰威,等.酱油掺假检测技术的研究进展[J].中国调味品,2013,38(11):103-105.

[2]李名梁.我国食品安全问题研究综述及展望[J].西北农林科技大学学报:社会科学版,2013,13(3):46-51.

[3]中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.33-2003,食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[4]杨玉珍,彭方仁,曹一达.不同种源香椿芽硝酸盐、亚硝酸盐及VC含量变化的研究[J].食品科学,2007,28(6):48-50.

[5]陈金娥,李冬梅,赵戌利,等.10种生、熟蔬菜中VC含量及抗氧化性对比研究[J].食品科技,2012,37(4):57-59.

[6]万学闪,刘文革,阎志红,等.西瓜果实发育过程中番茄红素、瓜氨酸和VC等功能物质含量的变化[J].中国农业科学,2011, 44(13):2738-2746.

[7]王永菲,王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报:自然科学版,2005,14(3):236-239.

[8]刘星,陈义伦,张小丹,等.提取条件对洋葱提取物清除亚硝酸盐效果的影响[J].食品与发酵工业,2012,38(10):189-193.

Optimization of nitrite clear in sauce by VC using response surface methodology

JIALIEXI·Manafu1,DENA·Turehan2,LI Junfang1(1.School of Chemical Engineering Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2 School of Mathematics and Physics,XinjiangAgricultural University,Urumqi 830052,China)

Soy sauce was regard as raw material,on the basis of single factor test,The paper chosed effect of concentration of VC,reaction temperature,pH as dependent variable,and chosed scavenging rate of nitrite as response value.According to the responsed surface Box-Benhnken experimental design principle,the simulation prediction model of two order polynomial equation was observed with three factors and three levels method to optimizing the clear conditions of nitrite in sauce.The regression prediction model was highly significant and the equation fitting to the test preferably,and also could analyze and forecast on nitrite scavenging rate in soy sauce.The response surface plots showed that the VC concentration with reaction temperature,VC concentrationed with pH,pH with reaction temperature interacts was not significant.This also was consistent to the analysis results of thePvalue of regression model interactiveterm.The optimum conditions for VC clear the nitrite in sauce,VC concentration was 0.48 μg·mL-1, reaction temperature was 46.08℃,pH was 2.38.Under the optimal conditions,the nitrite clear rate in saucecould reach to 50.1%,the measured value was 52.4%,which was close to each other and the fitting was good,this test showed that the Box-Behnken center-united experimental design principle with response surface method was feasible to optimize the clear conditions of nitrite in soy sauce.

soy sauce;nitrite;VC;clear;response surface methodology

R284.2

A

1005-9369（2014）07-0124-05

时间2014-7-7 8:20:48 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.016.html

加列西·马那甫,德娜·吐热汗,李俊芳.VC清除酱油亚硝酸盐的响应面优化[J].东北农业大学学报,2014,45(7):124-128.

Jialiexi·Manafu,Dena·Turehan,LI Junfang.Optimization of nitrite clear in sauce by VC using response surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):124-128.(in Chinese with English abstract)

2014-03-22

新疆农业大学校前期项目（XJAU201302）

加列西·马那甫（1964-），男，副教授，研究方向为实用药物分析。E-mail：jialiexi@sina.cn