苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵条件的优化

赵奎军，邢亚楠，韩岚岚，孙文鹏，张红玉，李 冉，韩晓旭

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007）

苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵条件的优化

赵奎军1，邢亚楠1，韩岚岚1，孙文鹏2，张红玉1，李 冉1，韩晓旭1

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007）

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）Bt20菌株为东北农业大学农业昆虫与害虫防治实验室分离出来的具有独立知识产权的菌株，其对鳞翅目幼虫具有较强杀虫活性，具有良好推广应用价值。文章进行优化Bt20菌株的液态发酵培养基碳源、氮源材料研究，试验以Bt20菌株发酵液吸光度值及对2龄小菜蛾的毒力效果为指标，首先采用单因素试验对Bt20菌株发酵培养基的碳源及氮源进行优化，筛选得到最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为蝇蛆、酵母粉、鱼粉、大豆粉；运用正交试验设计方法对优化后的碳、氮源进行正交试验，明确Bt20菌株最佳液态发酵培养基配方为：玉米粉3.0%、蝇蛆3.0%、大豆粉3.0%、酵母粉2.0%；最佳发酵培养基下，Bt20发酵液吸光度值为1.4733，发酵液处理2龄小菜蛾，3 d后校正死亡率为98.31%，显著优于鱼粉发酵液的吸光度值1.0683及校正死亡率88.14%，提高发酵产物产量和毒力，降低生产成本，可为Bt20商品化及大规模应用提供基础依据。

苏云金芽胞杆菌Bt20；发酵条件优化；最佳发酵培养基

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上产量和使用量最大的微生物杀虫剂，已有200多种商品制剂，占整个生物杀虫剂市场53%的份额，每年约产生120～140亿美元税收，在农林害虫防治中应用广泛，发展前景广阔[1-2]。近年来，有许多新的Bt菌株不断被发掘，但应用到生产中，还要经历助剂、复配、发酵等研发过程。

高效培养基的筛选对Bt工业化发酵生产至关重要。Stanbury等估测生产Bt杀虫剂所需原材料成本占整个生产成本35%～59%[3]。因此，找到能使苏云金芽胞杆菌高产并降低生产成本的发酵原材料是规模化商品化生产的基础[4]。研究表明，Bt对营养要求不严，在含氮量0.075%～0.225%、含糖量0.1%～1.5%、糖氮比0.44～20.0营养条件下生长良好[5]。国际上常用鱼粉、大豆粉、昆虫蛹、复杂的工农业废物（木薯淀粉，玉米淀粉，稻草，麦麸，玉米浆酒，甘蔗糖蜜，干酪乳清和椰子废物等）[6-11]及工业废水、污泥[12-13]代替高成本发酵介质，降低Bt杀虫剂生产成本。

虽然国内外对Bt发酵培养基优化研究有诸多报道，发酵技术相当成熟，但对于不同的Bt菌株其最适发酵培养基及条件不同[5]。本研究主要采用单因素及正交试验，以发酵液吸光度值及杀虫毒力为标准，对东北农业大学农业昆虫与害虫防治实验室独立分离的对鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bt20（以下简称Bt20）菌株发酵条件进行优化，为该菌株产业化、规模化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供式菌株

苏云金芽胞杆菌Bt20菌株为东北农业大学农业昆虫与害虫防治实验室保留菌株，中国微生物菌种保藏中心保藏（保藏号：GMCCNO，1710）。经前期工作筛选得到的对十字花科蔬菜危害严重的鳞翅目害虫有较高毒力。

1.2 牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，定容至1 L，pH 8.0的Tris-HCl调节pH 7.2，灭菌保存备用。

1.3 活化菌种的制备

挑取在LB固体培养基活化的菌种Bt20，一菌环接种到5 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温，230 r·min-1振荡培养12 h后，以1%接种量再转 接到新的5 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养12 h，二次活化，准备接种。

1.4 碳源筛选

以2.0%蛋白胨作为培养基氮源，0.03% K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02% ZnSO4作为培养基无机盐，固定氮源及无机盐不变，再分别以2.0%玉米粉、玉米淀粉作为碳源，筛选不同碳源对Bt20菌株发酵的影响。

1.5 氮源筛选

以2.0%玉米粉作培养基碳源，0.03%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02%ZnSO4作为培养基无机盐，固定碳源及无机盐不变，再分别以2.0%大豆粉、鱼粉、蝇蛆、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵为氮源，筛选不同氮源对Bt20菌株发酵的影响。

1.6 碳氮源正交培养基筛选

基于碳、氮源单因素试验结果，筛选出以玉米粉作为唯一碳源，大豆粉、鱼粉、蝇蛆、酵母粉作为氮源的4个因素，每个因素设定3个水平，采用L18（37）正交表进行氮源比较分析试验（见表1），随机安排因素和浓度水平[14]。

1.7 培养方法

按各配方配制培养基50 mL，装入250 mL三角瓶中灭菌，将在牛肉膏蛋白胨培养基中活化的Bt20按1%量接种到发酵培养基中，30℃、230 r·min-1发酵振荡培养，发酵至芽胞晶体形成并有30%以上胞晶分离时终止，每个处理3次重复。

表1 Bt20菌株碳氮源正交试验因素和水平设计Table 1 Orthogonal experimental factors and levels design of strain Bt20 carbon and nitrogen sources（%）

1.8 吸光度测定方法

以未发酵（空白）培养基作为对照，每隔4 h，吸取发酵培养液100 μL，加2 900 μL灭菌蒸馏水，稀释30倍，分别测定各个配方培养液吸光度值OD600，依此绘制菌体生长曲线。

1.9 生物活性测定

采用叶片浸渍法，测定Bt20菌株各配方发酵液对小菜蛾2龄幼虫的杀虫效果。将各配方发酵液分别稀释100、200、400、800、1 600、3 200倍，将无菌新鲜的白菜叶片剪成7 cm圆片，浸泡在稀释好的发酵液中10 s，取出自然晾干，然后放入培养皿中，每个浓度接入20头健康、大小一致的2龄小菜蛾幼虫，重复3次，以加清水处理为空白对照，置于24～26℃，相对湿度60%～70%人工气候箱中，饲养72 h后，调查存活死亡情况，计算LC50[15]。

1.10 数据处理与分析

数据均采用Excel 2010和DPSv7.05数据处理系统进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对Bt20发酵液OD值的影响

以2.0%蛋白胨作为氮源，图1表明，不同碳源对Bt20整个发酵过程OD值的影响：0～8 h玉米淀粉对发酵液OD值的影响优于玉米粉。但8 h至整个发酵周期结束，玉米粉对发酵液OD值的影响要高于玉米淀粉。

图2表明，在P＜0.01水平下，振荡培养40 h时，以玉米粉为主要碳源的Bt20发酵液最大吸光度值为0.729，极显著优于振荡培养44 h时以玉米淀粉为碳源的发酵液最大吸光度值0.679。总体来看，Bt20对碳源的利用效率为，玉米粉优于玉米淀粉。

图1 不同碳源对Bt20菌株发酵过程吸光度值的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the absorbance values in strain Bt20 fermentation process

图2 不同碳源对Bt20菌株最大吸光度值的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

2.2 不同氮源对Bt20发酵液OD值的影响

以2.0%玉米粉为碳源，针对氮源进行筛选的结果表明（见图3、4）。Bt20对不同氮源的利用情况不同，其主要是利用有机氮源。图4表明，对蝇蛆的利用效率最高，在P＜0.01水平下，极显著优于其他氮源，其最大吸光度值为0.654，较最低的硫酸铵高出两倍，其次是酵母粉、鱼粉OD值分别为0.623、0.582。虽然蛋白胨和大豆粉最大吸光度值存在极显著差异，但从整个生长周期看（见图3），蛋白胨最佳产胞时间为48 h，远长于大豆粉最佳产胞时间36 h。，从发酵生产成本看，蛋白胨价格是大豆粉的8倍。从生产应用角度选择大豆粉作为Bt20发酵培养基氮源。被利用效率最低的是硫酸铵，为无机氮源，以其作氮源在整个发酵过程中Bt20不产生芽胞及伴胞晶体。综合分析，Bt20对氮源利用效率从高到低依次为：蝇蛆＞酵母粉＞鱼粉＞大豆粉＞蛋白胨＞硫酸铵。

2.3 Bt20发酵培养基碳源、氮源优化正交试验分析

Bt20碳源、氮源优化正交试验统计结果，见表2。

将Bt20碳源、氮源优化正交试验吸光度值统计结果用Duncan新复极差法进行分析，结果表明：玉米粉作为发酵培养基的唯一碳源时，其1水平（3.0%）的OD值＞2水平（2.5%）OD值＞3水平（2.0%）OD值，即玉米粉含量与发酵液OD值在一定范围内呈正相关，说明碳源是Bt20生长发育的必需因素。因此，选择1水平（含3.0%）玉米粉。

蝇蛆作为发酵培养的主要氮源，含丰富氨基酸，在其质量分数为0、1.5%、3.0%时，发酵液吸光度值分别为0.7173、0.7383、0.8878。说明其含量变化影响Bt20发酵液的OD值，具有极显著促进作用。由表3极差分析可知，蝇蛆极差R′= 0.2172，明显高于其他材料提供的氮源极差，这说明蝇蛆是这几种材料中氮源利用效率最高的材料，因此选3水平（含量3.0%）。

同理，由极差分析可知，其他各因素对Bt20发酵液的吸光度值影响从高到低依次为：E酵母粉＞A×B＞B鱼粉＞D大豆粉＞A×C。其中，酵母粉3水平＞1水平＞2水平，选3水平（2.0%）；鱼粉1水平＞3水平＞2水平，应选1水平，但是A×B互作对发酵吸光度值的影响比鱼粉的影响要大，互作中3水平＞1水平＞2水平，因此鱼粉应选3水平（0），表明在该培养基配方组合中鱼粉对该发酵液OD值影响不大；而大豆粉3水平＞2水平＞1水平，应选3水平（3.0%）。

综合上述试验结果，Bt20最佳液体发酵培养基组合：A1B3C3D3E3即配方3玉米粉3.0%，蝇蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。

图3 不同氮源对Bt20菌株发酵过程吸光度值的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the absorbance value in strain Bt20 fermentation process

图4 不同氮源对Bt20菌株最大吸光度值的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

表2 Bt20菌株正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal experimental design and results of strain Bt20

表3 Bt20菌株正交试验极差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment of strain Bt20

2.4 发酵培养基对Bt20菌株发酵毒力的影响

Bt20菌株在18种不同发酵配方下振荡培养产生的发酵液对2龄小菜蛾的杀虫效果如表4所示，Bt20不同配方振荡培养产生的发酵液即使在较高稀释倍数时也对2龄小菜蛾有较高杀虫活性，如Bt20菌株在配方1、2、3、4、6振荡培养产生的发酵液，即使在1 600倍的较高稀释倍数下，对小菜蛾校正死亡率在72 h仍达65%以上，尤其是配方3的校正死亡率可达85%。在P＜0.05水平时，配方3 的100、200、400倍发酵液稀释液对小菜蛾的校正死亡率均达最高水平，且差异不显著，结果表明，Bt20菌株在配方3培养基中所产发酵液对2龄小菜蛾的杀虫效果为18种配方中最高。

由表4可知，Bt20菌株在配方3培养基中产生发酵液对2龄小菜蛾的LC50为2.11×104cfu·mL-1，其次是配方4所产的发酵液对2龄小菜蛾的LC50为2.45×104cfu·mL-1，而配方18和16的发酵液毒力最差，其LC50分别为1.62×106和1.48×106cfu·mL-1，配方3、4的毒力约是配方18和16的60～77倍，也显著优于其他配方组合。因此，在配方3发酵培养基下产生的Bt20发酵液对2龄小菜蛾杀虫活性最强。该结果与菌株发酵液OD值统计结果一致。

表4 Bt20碳氮源正交组合对小菜蛾杀虫活性测定Table 4 Insecticidal activity of carbon and nitrogen source orthogonal combination of strain Bt20 against Plutella xylostella

续表4

4 讨论与结论

本试验结果表明，Bt20菌株发酵最优配方为A1B3C3D3E3，即配方3：玉米粉3.0%，蝇蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。经正交试验极差分析得出，Bt20对作为碳源的玉米粉及作为氮源的蝇蛆利用效率明显高于其他材料，相应对小菜蛾毒力也优于其他发酵培养基配方；Bt20对同样作为氮源鱼粉利用效率却不高，如发酵配方1（不含有蝇蛆）发酵液OD值为1.0683，是最优配方3（不含鱼粉）OD值1.4433的7/10倍，配方1的LC50为4.37× 104cfu·mL-1是配方3的LC50为2.11×104cfu·mL-1的2倍；对小菜蛾毒力试验结果表明，配方3稀释3 200倍发酵液在72 h校正死亡率为84.74%，而配方1稀释3 200倍的发酵液在72 h的校正死亡率仅为62.74%，杀虫毒力明显比配方3低。这可能是由于蝇蛆自身蛋白质含量、各氨基酸比例及所含矿物质更适合被Bt20菌株利用，为Bt20菌株发酵培养基提供充足氮源。研究者为降低成本、减少浪费，对Bt发酵培养基组分进行大量研究，目前有利用农业废弃物、工业废水污泥等培养Bt，如：用鸡粪上清液、淀粉厂废水[16]、大豆粉+海水[17]等为原料培养Bt，其产胞量分别为2.46×108、2.90× 108、5.20×108cfu·mL-1，本配方产胞量为5.92×108cfu·mL-1，说明蝇蛆相比于废水等能更有效被Bt利用。

陈在佴等研究表明，对苏云金杆菌99-11菌株发酵影响最显著的是碳源（玉米淀粉），其次是氮源（酵母粉）影响[18]；吴继星等研究各因素对苏云金杆菌79007菌株发酵影响顺序为：葡萄糖＞添加剂＞玉米浆＞淀粉＞豆饼粉＞蛋白胨＞酵母粉，其中碳源（葡萄糖）的影响最大[19]；高鹤永等利用正交法优化Bt发酵培养基，得到影响发酵主要因素为碳源（玉米粉）＞氮源（豆饼粉）＞氮源（花生饼粉）[20]。本研究也发现Bt20对作为碳源的玉米粉利用效率高于氮源，但与袁志明等研究中氮源对Bt发酵菌数影响要优于碳源结果[21-22]不一致。这说明不同苏云金杆菌亚种对不同类型碳源和氮源利用能力不一样[5]；不同来源的同种原料，其营养成分及配比均不同，对Bt菌株发酵有影响[23]。

从发酵成本上看，由于鱼粉是传统优质蛋白，被广泛应用于Bt发酵原材料中，但价格昂贵，约为10 300～10 400元·t-1，使用受限。而本试验表明Bt20对蝇蛆利用效率明显高于鱼粉，价格低廉约5 000～7 500元·t-1，是鱼粉价格1/2～7/10倍，即生产每升Bt发酵液，需要0.84元，其综合成本低于以鱼粉为氮源的配方，更利于应用推广。

从发酵时间上看，本研究优化配方发酵时间76 h，较一般Bt发酵时间长（48 h）[24]，说明该配方营养物质丰富，使Bt20菌株进入对数生长期后，仍能获得满足其生长所需营养物质，继续积累Bt20的菌体数量，提高其产量[25]。

从发酵机制上看，本研究仅是在室内摇瓶条件下对Bt20的配方进行优化，与实际发酵罐生产存在一定差别。①本研究实通过添加Tris-HCl缓冲液及CaCO3对发酵液的初始pH进行控制，相比于发酵罐，无法实时检测发酵过程中pH变化，无法确保发酵进程顺利进行。②本研究采用一次性投料发酵，底物浓度较高，会抑制发酵进程，导致发酵时间较长，发酵罐采用分批补料发酵方式避免过多底物对发酵过程抑制，能缩短发酵时间。③本研究摇瓶培养溶氧量较发酵罐机械搅拌溶氧量低，而Bt是好氧型微生物，发酵罐效果更好[26]。本研究中所得配方为利用发酵罐规模化生产提供数据支持，可利用发酵罐的实时在线监测系统对该配方的原材料配比、pH变化、通气量进一步优化，为Bt规模化商品化生产奠定基础。

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Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20

ZHAO Kuijun1,XING Yanan1,HAN Lanlan1,SUN Wenpeng2,ZHANG Hongyu1,LI Ran1,HAN Xiaoxu1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2. HeilongjiangAgriculture Vocational and Techical College,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

Bacillus thuringiensisstrain Bt20 isolated in our laboratory with independent intellectual property right,had a high insecticidal activity that lepidopteran larvae and possess better popularization and application value.In this paper,we studied that how to optimize the carbon source and nitrogen source materials of Bt20 strain liquid fermentation medium,with the strain Bt20 fermentation broth absorbance value and the virulence against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostellaas indices.Firstly,the single factor tests was performed to optimize the carbon source and nitrogen source materials of strain Bt20 liquid fermentation medium,the obtained optimal carbon source material and nitrogen source materials were the corn flour and the maggot,yeast flour,fish meal,soybean flour,respectively.Secondly,the orthogonal test was performed to the optimal carbon and nitrogen source materials.Experimental results showed that the appropriate formula of liquid fermentation medium was 3.0%corn flour,3.0%maggot,3.0%soybean flour and 2.0% yeast flour.Absorbance value of the optimal fermentation medium was 1.4733 and corrected mortality was 98.31%against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostella,after 3 d.The optimal fermentation medium wassignificantly better than the fish meal fermentation broth which the absorbance value was 1.0683 and corrected mortality was 88.14%.The optimized formula can improve the yield and virulence of fermentation products,reduce production costs,and provide fundamental basis for the commercialization and large-scale application of Bt20.

Bacillus thuringensisBt20;fermentation condition optimization;optimal fermentation medium

S476

A

1005-9369（2014）07-0045-09

时间2014-7-4 17:18:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.007.html

赵奎军,邢亚楠,韩岚岚,等.苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵条件的优化[J].东北农业大学学报,2014,45(7):45-53.

Zhao Kuijun,Xing Yanan,Han Lanlan,et al.Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):45-53.(in Chinese with English abstract)

2014-01-13

现代农业产业技术体系建设专项（CARS-04）；公益性行业（农业）专项资助（201103002）；国家级大学生创新训练项目（201210224002）

赵奎军（1960-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为农业昆虫与害虫防治。E-mail：kjzhao@163.com